单细胞质谱分析的现状与发展

　　2015年10月17日，第二届全国质谱分析学术报告会在浙江大学紫荆港校区体育馆盛大开幕，在5位院士的精彩报告后，多位学者做了高水平的大会报告。

清华大学张新荣教授：单细胞质谱分析的现状与发展

　　清华大学张新荣教授做题为《单细胞质谱分析的现状与发展》的报告。细胞是生命活动的基本单元，在单细胞及亚细胞水平上对生命活动进行实时、原位、动态检测是生命科学对分析化学提出的一项挑战性的问题；要求分析化学家在时间、空间、定性、定量四个方面发展更为“精准”的方法；并解决单细胞“组学”分析、亚细胞区域“超分辨”成像、分子动态变化三个方面的难题。荧光探针是目前单细胞分析与成像的主要技术手段，已有多种荧光小分子/纳米/蛋白探针；已用于流式细胞检测、亚细胞区域定位、细胞中蛋白、基因、小分子代谢物的分析以及细胞动态行为研究。但荧光探针缺点是：受到分子光谱谱带宽度的限制，能够同时测定的组分数目有限，难以进行细胞中多组分分子的同时分析，也不适于细胞中未知成分的分析。而且，细胞中发生的生物过程常是多种分子系统作用的结果，因此发展单细胞分析方法，满足多组分同时分析的需求，并对细胞事件中的未知成分进行快速定性和精准定量，是单细胞生物学研究对分析化学的迫切需求。

　　质谱进行单细胞分析的优点为：（1）无需标记；（2）多组分同时分析；（3）精准定量。该领域取得的成果主要集中在以下技术：质谱流式细胞仪；TOF-SIMS分析；ESI-MS/MS分析；MALDI-TOF分析。

　　2011年SCIENCE发表了质谱流式细胞仪技术（Mass Cytometry），随后出现了一系列文章，主要使用各种金属元素作为标签，用ICP-MS对单细胞中的多种参数实现流式检测。在MDS公司2001年申请、2006年被授权的美国ZL中，专门提到了张新荣课题组2001年发表在AC和JAAS的工作。

　　飞行时间-二次离子质谱（TOF-SIMS）也可用于单细胞分析。SIMS离子束具有易于聚焦的特点，采用离子束照射单细胞样品，实现待测分子的质谱成像分析，有很高的分辨率，在生命科学研究中很有意义。2011年Nature发表了利用SIMS进行多同位素成像质谱定量干细胞的文章。Lechene等人采用TOF-SIMS，利用¹⁵N标记的胸腺嘧啶培养干细胞，对其中的DNA分子进行了成像分析，说明了不同生长周期小鼠的DNA分子在干细胞和提供给组织的后代细胞中的分配是否符合“不朽链”假说。TOF-SIMS的主要不足是在离子化过程中分子被裂解成了碎片，无法得到完整分子的信息。课题组已被AngewChem接收的最新文章中，用TOF-SIMS，成功对单细胞新生蛋白和特异的磷脂进行成像。在仪器装置搭建方面，南京大学-清华大学正在合作研制极紫外激光TOF-SIMS，有望解决分子碎裂的难题。

　　在单细胞电喷雾质谱分析方面，目前的nano-ESI可进行纳升进样，2014年AC上发表的文章，采用结合膜片钳的单细胞ESI-MS分析。采用膜片钳吸管技术能够在微损伤情况下从细胞吸出微量细胞质物质，再采用纳升电喷雾技术，即可获得细胞内代谢物的成分与含量的信息，Sweedler等用该法研究了单个神经细胞中多种神经递质的种类与含量，以及其对人的精神的抑制或刺激作用。张新荣课题组研发了皮升喷雾装置，并分析了植物单个干细胞，相对于纳升喷雾，皮升喷雾显著提高了喷雾时间，从3秒提高到3分钟，可在分析中获得更多信息。课题组还发展了步进电压的纳升喷雾技术，可以有效快速地去除小体积样品中的基质，在质谱图中可使目标物和基质有效分离，形成不同的谱带。用皮升喷雾装置检测amol级生物分子，并用结晶化来有效脱盐。在商品化的LESA基础上，课题组用液滴微萃取和皮升电喷雾技术，有效去除基质干扰，对单细胞进行分析。课题组还对离子阱采用脉冲式采样，也成功提高灵敏度，对单植物细胞的代谢物进行分析，并用中性丢失检索判断糖类的修饰类型。

　　今后，单细胞生物学的发展趋势是：（1）加强单细胞的“组学”研究；（2）亚细胞区域的高分辨时空成像研究；（3）在时间、空间和量三个方面达到“精准”的程度。