过去几年里，单细胞蛋白质组学技术取得了长足发展，单细胞蛋白质组学逐渐走向成熟，后续有望广泛应用于肿瘤异质性分析、免疫学研究、发育生物学、神经科学以及精准医学等领域。然而，从技术发展成熟到实际场景应用分析的过程中，我们仍面临诸多挑战：1.当前单个细胞的蛋白鉴定深度还有待进一步提升以更好回答科学问题；2.在实际应用场景中，单细胞状态及尺寸往往比实验室培养分选出来的单细胞要更差更小，更加考验整套流程方案可操作性和稳定性、仪器抗背景污染、灵敏度等实际性能；3.单细胞蛋白量少，如何确保最终鉴定蛋白的可靠性和准确性，对于后续真实反映生物学问题和临床需求至关重要。关于这些实际问题的探索，将有效推动单细胞蛋白质组学技术的发展以及在实际应用中的潜力和价值。
布鲁克长期关注单细胞蛋白质组领域前沿技术进展和需求，经历前期两代单细胞质谱平台的技术积累和经验，在2024年的ASMS大会上，布鲁克发布了第三代“真”单细胞蛋白质组学质谱平台 timsTOF Ultra 2，进一步提升实际应用场景分析灵敏度和高达300Hz扫描速度，成为破解单细胞蛋白质组学强有力的武器。布鲁克第三代“真”单细胞蛋白质组学解决方案基于CellenOne进行单细胞分选，搭配标准的384孔板作为载体进行单细胞样品前处理，可与 nanoElute 2 纳升液相无缝连接，直接上样进行色谱分离，后续在超高灵敏度和超快扫描速度的 timsTOF Ultra 2 上进行分析，结合实时数据检索软件ProteoScape™，实现单细胞蛋白质组学全流程方案。
所见即所得 ————————
布鲁克上海 Demo 实验中心 timsTOF Ultra 2 完美重现官方宣传数据，293T细胞消化液梯度稀释样本分析结果显示，21 分钟的分析时长，当样本量为 250pg（相当于单个人源细胞蛋白质总量）时，可鉴定近 6700 种蛋白质，对应超过5.5万条多肽。这一出色表现为单细胞及痕量蛋白质组学研究奠定了坚实的基础。同时可以发现仅需 16.125pg 的样本，即可鉴定超过 3000 种蛋白质，对应超过1.5万条多肽，极致灵敏度不仅支持常规单细胞分析，更能有效满足对小型免疫细胞、外周血单核细胞及亚细胞器等超微量样本的研究需求。
图2：上海Demo实验中心293T细胞消化液实测结果
“真”
单细胞分析 ————————
基于布鲁克第三代成熟且可复制的单细胞蛋白质组学解决方案，在上海Demo实验中心完成了培养细胞的分选，共制备了25个尺寸20-25μm的293单细胞样本，仅用21分钟的色谱梯度，在单个细胞水平上成功鉴定出超过6000种蛋白质和超过5.4万条多肽，显著提升鉴定深度，展现了对单个细胞的深度覆盖能力。
图3：293单细胞分析结果
“实”际多场景
真单细胞分析 ————————
实际样品分析相比标准培养细胞系面临更多挑战，实际场景中往往面临细胞的稀缺性、更复杂的基质背景体系和偏小的细胞尺寸等。为了评价 timsTOF Ultra 2 实际应用场景分析性能，选取了两种极具代表的单细胞应用场景：组织中提取的干细胞和更小的免疫细胞。
（1）肌肉干细胞在促进肌生成和抵抗衰老方面发挥着重要作用，可以为理解肌肉衰老机制和肌肉再生治疗提供独特视角。我们成功分析了10个直径为10-15μm的小鼠肌肉组织提取的肌肉干细胞， 15分钟分析时长下，单个小鼠肌肉干细胞成功鉴定出超过4100种蛋白质和30000条多肽，包含多种干细胞标志蛋白。
图4：“实”际多场景下单细胞分析结果
“准”确可靠
单细胞分析 ——————————
单细胞含蛋白量少，很容易引起质谱谱图质量差和多肽鉴定数目偏低的问题，从而造成鉴定蛋白的可靠性和准确性低。有报道表明，虽然单条肽段匹配即可鉴定一种蛋白质，但通过同一蛋白的第二条和其它多条肽段进行验证，可有效确证初次鉴定，大幅提升统计置信度。多肽段共同指向同一蛋白的策略能有效排除错误鉴定，显著提高鉴定结果的可信度（Zhang, Y. et al. Journal of Proteomics 2015）。因此，实验最后统计了实测数据中不同来源单细胞样本中每个蛋白对应多肽情况，可以发现基于 timsTOF Ultra 2 平台测试结果中，每个蛋白质平均由7~8条多肽匹配鉴定，超过50%鉴定蛋白对应鉴定多肽大于3条。这一特性为蛋白质的可靠鉴定和准确定量奠定了坚实基础，通过多肽段的高覆盖，可有效增加结果的可靠性。同时，也使得其非常适合肽组学、免疫肽组学以及一些未知蛋白发现鉴定分析。
图5：不同单细胞样本中单个蛋白对应的肽段数目统计
总的来说，基于 timsTOF Ultra 2 的单细胞质谱平台不仅能够在真正单个细胞中实现蛋白质组的深度覆盖，还在面对复杂实际分析场景时展现出卓越且稳定的分析性能。同时，单细胞水平上每个蛋白鉴定平均对应多条肽段的指认策略，大幅提升了结果的可信度。兼顾“真实准”，三驾马车并驾齐驱的4D-单细胞技术将为单细胞蛋白质组学的“真实”世界场景分析和应用转化提供强有力的支持，挖掘出更丰富的生物信息，为生命科学领域的研究与创新开辟全新的可能。
参考文献：
1. Single-cell proteomics: challenges and prospects. Nature Methods 20, 317-318 (2023).
2. Lee, S., et al. Advances in Mass Spectrometry-Based Single Cell Analysis. Biology 12, 395 (2023).
3. Brunet, A., et al. Ageing and rejuvenation of tissue stem cells and their niches. Nature Reviews Molecular Cell Biology 24, 45-62 (2023).
4. Klebanoff, C.A., et al. T cell receptor therapeutics: immunological targeting of the intracellular cancer proteome. Nature Reviews Drug Discovery 22, 996-1017 (2023).
5. Zhang, Y., et al. ProteinInferencer: Confident protein identification and multiple experiment comparison for large scale proteomics projects. Journal of Proteomics 129, 25-32 (2015).
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