单链DNA文库的SELEX筛选实验

3' 引物 链亲和素磁珠

电泳仪 PCR 仪 离心机 凝胶成像仪 液体闪烁仪 长波紫外灯 紫外分光光度计 核酸定暈仪 pH计 培养箱 振荡器 洁净工作台

一、材料与设备

1. 5' '端标记有生物素的 3' 引物。

2. 链亲和素磁珠（Promega 公司）。

其他设备与试剂与 RNA 文库方案一致。

二、操作方法

1. 不对称 PCR 制备 ssDNA

(1) 首先将筛选获得的 ssDNA 参照 RNA 文库的实验方案扩增成双链 DNA，纯化回收。

(2) 确定不对称 PCR 制备 ssDNA 文库所需的最佳双链 DNA 模板量。取不同量的上述 PCR 产物为模板，不对称 PCR 扩增 35 个循环。

不对称 PCR 反应体系如下：10X PCR 反应缓冲液 10 μl，dNTP 混合液 8 μl，5' 引物（25 pmol/μl )  2 μl，3' 引物（1 pmol/μl )  0.5 μl，dsDNA 模板 不定，Taq DNA 聚合酶（2 U/μl ) 1 μl，加去离子水补齐至 100 μl。

PCR 反应条件：95℃ 预变性 5 min；94℃ 变性 30 s，55℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30s，扩增 35 个循环；最后 72°C 终延伸 5 min。

含 7 mol/L 尿素的 12% 变性 PAGE 观察，单链 DNA 条带应比双链 DNA 的条带略为偏上，挑选出能产生大量且条带清晰的单链 DNA 的双链 DNA 模板最作为最佳量。

(3) 取最佳双链 DNA 模板量进行大量不对称 PCR 扩增，含 7mol/L 尿素的 12% 变性 PAGE 切胶纯化，然后用核酸定量仪确定 ssDNA 的量用于下一轮筛选。

(4) 在第一轮筛选中，投入的 ssDNA 是直接合成的。

2. 链亲和素磁珠制备 ssDNA

(1) 用 5' 端标记有生物素的 3' 引物将筛选获得的 ssDNA 扩增成双链 DNA，纯化回收，用 SHMCK 缓冲液溶解至 20 μl。

(2) 链亲和素磁珠的准备。取 0.5 ml 链亲和素磁珠用 0.5X SSC 洗三遍，每次 600 μl，每次 1 min，再用 SHMCK 缓冲液洗三遍，每次 600 μl，每次 1 min。

(3) 将双链 DNA 与磁珠混合，再加入 40 μl SHMCK 缓冲液，室温孵育 30 min（在 DNA 混合器上使之充分混合）。

(4) 磁铁吸附后弃上清，用 SHMCK 缓冲液洗三遍，每次 600 μl，每次 1 min。

(5) 加入 0.15 mol/L NaOH 400 μl，将双链 DNA 裂解为 ssDNA，于 37℃ 孵育 15 min。

(6) 磁铁吸附后吸出上清，并加入 20 μl 3mol/L HCl 中和其中的 NaOH，调整其中的缓冲体系为1X SHMCK，0.1% 明胶，12 μg/μL tRNA，总体积为 500 μl，进入下一轮筛选。

防止RNA酶的污染。

一、 防止RNA酶污染的措施 

1.  所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 

2.  塑料器皿可用0.1％ DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。 

3.  有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3％ H2O2 室温10min，然后用0.1％ DEPC水冲洗，晾干。 

4.  配制的溶液应尽可能的用0.1％ DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 

5.  操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 

6.  设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 

二、常用的RNA酶抑制剂 

1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 

2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 

3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 

4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 

5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

本实验来源《RNA 实验指导手册》主编：郑晓飞。