厌氧微生物的培养实验

实验方法原理 焦性没食子酸与碱性溶液作用后，形成碱性没食子酸盐，在此反应过程中能吸收氧气而造成厌氧环境；牛肉渣内既含有不饱和脂肪酸能吸收氧，又含有谷胱甘肽（glutathione）能形成负氧化还原电位差；厌氧罐是采用某种方法除去其中的氧，例如将镁与氧化锌制成产氢气袋，放入罐中加水反应产生氢，钯或铂是催化剂，在常温下催化氢与氧化合成水，则可除去密封的厌氧罐中的氧。

实验材料 巴氏芽孢梭菌荧光假单胞菌

试剂、试剂盒 焦性没食子酸棉花NaOH石蜡凡士林牛肉蛋白陈葡萄糖 NaCl肉膏蛋白胨琼脂培养基

仪器、耗材 厌氧罐催化剂袋气体发生袋指示剂袋试管玻璃板滴管烧瓶刀

实验步骤

1.  焦性没食子酸法

（1）大管套小管法在大试管中放入少许棉花和焦性没食子酸，焦性没食子酸的用量按它在过量碱液中能每克吸收100 ml 空气中的氧来估计，本实验用量约0.5 g。接种巴氏芽孢梭菌在小试管肉膏蛋白胨琼脂斜面上，迅速滴入10%的NaOH于大试管中，使焦性没食子酸润湿，并立即放入除掉棉塞已接种菌的小试管斜面（小试管口朝上），塞上橡皮塞或拧上螺旋帽，置30℃培养。

（2）培养皿法取玻璃板一块或用培养皿盖，铺上一薄层灭菌脱脂棉，将1 g 焦性没食子酸放于其上。用肉膏蛋白陈琼脂培养基倒平板，待凝固稍干燥后，在平板上一半划线接种巴氏芽孢梭菌，下一半划线接种荧光假单胞菌，并在皿底用记号笔作好标记。滴加10%NaOH溶液约2 ml 于焦性没食子酸上，切勿使溶液溢出棉花，立即将已接种的平板覆盖于玻璃板上或培养皿盖上，必须将脱脂棉全部罩住，焦性没食子酸反应物切勿与培养基表面接触，以溶化的石蜡凡士林液（即vaspar）密封皿底与玻璃板或皿盖的接触处。置30℃温箱培养。

2.  疱肉培养基法

（1）取已除去筋膜、脂肪的牛肉500 g，切成小方块，置1000 ml 蒸馏水中，以小火煮1小时，用纱布过滤，挤干肉汁，将肉汁保留备用。再将肉渣用绞肉机绞碎，或用刀切碎，最好使其成细粒。

（2）将保留的肉汁加蒸馏水，使总体积为2000 ml，加入20 g蛋白陈，2 g葡萄糖，5 g NaCl和绞碎的肉渣。置烧瓶中摇均匀，加热使蛋白胨溶化。

（3）取上层溶液调整pH为8.0，在烧瓶壁上用记号笔标明瓶内液体高度，1.05 kg/cm2，121.3℃灭菌15分钟后补足蒸发的水量，重新调整pH为8.0，再煮沸10~20分钟，补足水量，再调整pH为7.4。

（4）把烧瓶内容物摇匀，将溶液和肉渣分装于小试管中，肉渣约用，应用无菌手续加入已灭菌的石蜡凡士林，以隔绝氧气。

（5）接种前可将上述已做好的庖肉培养基煮沸10分钟，以除去溶入的氧，如果盖有一层石蜡凡士林，需将石蜡凡士林先在火焰边微加热，使其溶化。在培养基手感不烫时按液体接种法接入巴氏芽孢梭菌，然后将接种的试管垂直，使石蜡凡士林凝固而密封培养基。再置30℃中培养。

3.  厌氧罐培养法

（1）用肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平板，凝固干燥后，取两个平板，每个平板一半边划线接种巴氏芽孢梭菌，另一半边划线接种荧光假单胞菌，并标记好。取其中的一个已接种的平皿置于厌氧罐的培养皿支架上，而后放入厌氧培养罐内；另一个已接种的平皿置培养室30℃培养。

（2）剪开催化剂袋，将催化剂倒入厌氧罐盖下面的多孔催化剂盒内，拧紧催化剂盒的盒盖。

（3）剪开气体发生袋的切碎线处，并迅速将此气体发生袋置罐内金属架的夹上，再向袋中加入约10 ml 水。同时，由另一人配合，剪开指示剂袋，将指示条暴露，立即放进罐内。

（4）迅速盖好厌氧罐的盖，将固定梁旋紧，置30℃培养。