原代细胞周期测定的原理和BrdU方法

原理:
细胞周期:细胞一世代所经历的时间从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现采用其他方法测群体周期。
测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计法等。
BrdU（5溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。
试剂
1、仪器、用品：同常规细胞培养
2、试剂：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液
BrdU方法
　　1、原代细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，最终浓度为10μg/ml。
　　2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。
　　3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。
　　4、常规染色体制片。
　　5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。
　　6、弃去2×SSC液，流水冲洗。
　　7、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。
　　8、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。
　　9、计算：细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时）
附：
（1）BrdU配制：BrdU 10mg十双蒸水10ml 4℃下避光保存。
（2）2×SSC配制：NaCl 1.75克，柠檬酸三钠•2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。