原代细胞计数的操作步骤

一、原代细胞计数 

1. 将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 

2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 

3. 静置3分钟。 

4. 镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： 

    细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 

二、原代细胞活力 

1. 将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 

2. 加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 

3. 吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 

4. 镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。 

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。 

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。 

三、MTT法测细胞相对数和相对活力 

活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。 

1. 细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。 

2. 沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。 

3. 37℃下保温2小时。 

4. 加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。 

5. 1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。 

注意：MTT法只能测定原代细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 

附：

1、0.4%台盼兰染液配制： 

    台盼兰 0.4克 加双蒸水至100 ml。 

2、MTT配制： 

    MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。 

3、酸化异丙醇配制： 

    异丙醇中加入HCl使zui终达0.04mol/L。