原代细胞培养之——培养技术

原代细胞的培养也叫初代培养 是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。

原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。

1、组织块培养法

组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。其培养方法如下：

(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。

(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20～30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。

(3)培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。 

原代细胞培养－2

2.消化培养法

该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。

某些特殊类型细胞，如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤，将在有关章节中叙述。

3.悬浮细胞培养法

对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。

4.器官培养

器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活，器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移植创造了便利的条件。器官培养的条件与细胞培养不同，要有特殊的要求。

1.  器官培养的特殊的要求

(1)需要特殊的培养条件 因器官离体培养，其营养和氧气仅靠自然渗透来供给，因此，培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造成坏死，其厚度或直径不宜超过1mm。

(2)器官内部细胞需要有足够的氧气渗入 常采用以下两种方法：

① 将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换。

提高培养基中的氧分压，一般需加注纯氧，提高氧分压时仍需保持5% CO2，以维持pH。

2. 器官培养的方法

(1)将不锈钢网做成的支架，放置于培养皿中，高度为1/2皿高，使其表面铺上0.5mm孔径的滤膜。

(2)将培养基加入平皿中，使培养液刚刚接触到滤膜，但不要使滤膜浮起。

(3)将要培养的器官组织平放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2，如为肝、肾不能大于1mm2。

(4)将培养物置于CO2培养箱内，并加注氧气，调整氧分压达90%，培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。

(5)上述器官培养1~3周（每隔2~3天换液一次）后可用于实验和检测。