双光子荧光显微镜的技术特点和使用技巧

双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。为形态学、分子细胞生物学、神经科学、和药理学等研究领域中重要的研究手段。

　　1.双光子显微镜出现的背景----传统激光共聚焦显微镜的两大局限:

　　1)一是光毒性现象：因为共聚焦的针孔必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比;而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。

　　2)光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。

　　2.为什么说双光子显微镜一般不需要配备紫外激发激光器?

　　双光子显微镜技术是建立在双光子激发效应的基础上的一种荧光激发技术：荧光染料分子可以同时吸收低能量的两个光子而被激发(两个光子到达荧光分子的时间间隔小于1飞秒)，其激发效果可以等同于吸收一个1/2波长的高能量光子。例如，吸收两个红色波长的光子，相当于一个吸收紫外的分子。长波长的光子不易被细胞吸收，因此对活细胞的光毒性减少，也降低了光漂白。这样即起到紫外激发的功能，又避免了紫外光线对样品的伤害。

　　3.双光子显微镜的激光器有何特别之处?

　　双光子吸收几率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度(两个光子必须在10-18秒内到达)。双光子吸收截面很小，只有在具有很大光子流量的区域的荧光团才会被激发。因此所用激光器多为钛宝石激光器，可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度，且具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。主要的是在一个很小的范围提供非常高密度的光子，可以保证双光子的同时激发。

　　4.双光子激发的优点是什么?

　　1)增加了染料的选择性：共聚焦系统的激光器(Ar, Ar/Kr, HeNe)的激发光范围在 488nm - 647nm

　　这就意味着想用紫外激发荧光染料的实验进行，例如使用 DAPI , Hoescht

　　而双光子的激发波长是单光子的两倍，所以紫外激发的染料能被近红外光激发。

　　2)减少光漂白：因为光漂白减少的减少使得用 CFP/YFP 做荧光共振能量转移( FRET )的实验的成功率提高。

　　3)无需特殊的物镜：从硬件的角度出发，用近红外光的波长激发紫外激发染料不需要特殊的紫外光学组件。

　　4)提高信噪比：激发光波长和发射光波长具有很大的差别，提高了信噪比。

　　5)漂白局限于焦点处：因为荧光激发只发生在物镜的焦点上，所以就不需要共聚焦针孔了。这样提高了光的检测，而且光漂白只发生在焦点上。

　　6)更容易穿透标本：红外波长的光不易被细胞散射，能穿透更深的标本。

　　5.相对于激光扫描共聚焦显微镜，双光子显微镜做的大改进是什么?

　　1)减少了光漂白。

　　2)减少了光毒性。

　　3)不易散射，更易穿透厚样品，诸如脑片。