双抗体夹心ELISA法检测待测样品sTNFα的含量

实验概要

本实验利用双抗体夹心ELISA法检测了待测样品sTNF-α的含量。选用两株针对TNF-α分子不同位点的单克隆抗体，即McAb₁(包被抗体)与McAb₂(酶标抗体)。先用McAb₁包被固相载体，使待测sTNF-α与之特异性结合，然后再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的McAb₂，则形成McAb₁-sTNF-α -HRP标记McAb₂复合物，再加入HRP底物，则酶催化底物显色，测定样品与标准品光密度值(即OD值)，绘制标准曲线，即可从标准曲线中查得待测样品中sTNF-α含量。

主要试剂

1. 包被抗体McAb₁：使用时用包被液作适当稀释(如1：100)。

2. 酶标抗体McAb₂：以辣根过氧化物酶(HRP)标记。使用时用稀释液作适当稀释，其稀释度根据预试验结果而定。

3. rhuTNF-α标准品：已知含量的rhuTNF-(10ng/ml)，使用时用稀释液作倍比稀释成7个浓度：5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，625pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，78 pg/ml。

4. PBS(0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液)

5. 包被液(0.05mol/L，pH9.6碳酶盐缓冲液)

6. 洗涤液(0.05%Tween-20-PBS)

7. 稀释液(含2% PEG的洗涤液或含10% BSA的PBS)：稀释液主要用来酶标McAb₂和标准品rhaTNFα。2% PEG洗涤液的配制：2.9g Nacl，2.0g PEG(MW6000)，0.6ml鸡蛋清溶于100ml PBS中。

8. 底物缓冲液(0.1mol/L，pH5.0的柠檬酸盐缓冲液)：称取1.79g Na₂HPO₄·12H₂O和1.29g柠檬酸，溶解至100ml双蒸水。

9. 底物液(显色液)：将5mg ABTS或10mg OPD 溶于 10ml底物缓冲液中，加入20μl 3% H₂O₂(临用前配制)。

10. 终止液(2mol/L的H₂SO₄)：量取20ml 98% H₂SO₄ ，缓缓加至80ml双蒸水中即可。

主要设备

1. 96孔酶标板(96孔ELISA板)，酶标测定仪，495nm滤光片。

2. 其他：4℃冰箱，水浴箱，刻度吸管，毛细吸管，加样器(头)等。

实验材料

1. 待测样品：如血清、血浆、尿液、细胞培养上清液等均可用于sTNF-α，后者应作适当稀释。

2. 阴性对照品：未免疫小鼠IgG。

实验步骤

1. 包被：将用包被液稀释好的McAb₁加入96孔酶标反应板，100μl /孔，置37℃温育2h后再移置4℃过夜(16-72h)；

2. 洗涤：将96孔酶标板倾去包被液，用洗涤液加满各孔，置室温3min，然后倾去。反复洗涤3次。

3. 加样(均设双复孔)。

   1) 将已知含量rHuTNF-α标准品用稀释液作倍比稀释后，分别加入1～7孔，100μl/孔，按浓度从低到高的顺序依次加样；

   2) 8孔加入待测样品，100μl；

   3) 9孔加阴性对照血清(未免疫小鼠IgG)，100μl；

   4) 10孔为空白对照(稀释液)，100μl/孔；

4. 加样后，置37℃孵育1～2h。洗涤3次，方法同前；

5. 各孔加入HRP标记的McAb₂，用稀释液作适当稀释，其稀释度根据预试验结果而定，100μl/孔；

6. 置37℃孵育1～2h；

7. 洗涤3次，方法同前；

8. 显色：各孔加新鲜配制的ABTS显色液(或OPD-H₂O₂显色液)，100μl/孔，置室温或37℃下避光反应15-30min

9. 终止反应：各孔加入终止液2mol/L H₂SO₄，50μl/孔；

10. 测定OD值：用酶标测定仪，以波长495nm测定各孔OD值。

注意事项

1. 血清或血浆中残存的凝块或红细胞须经离心去除，匆用溶血或血脂过多的血清检测TNF-α含量。

2. 待测样品在2-8℃可放置3d，超过3d应放入-20℃或-70℃冰箱，且应避免反复冻融，宜分装保存。

3. TNF-α标准品的质量直接影响待测样品结果的准确性，应注意商品试剂盒中的标准品可随时间延长而效价降低。

4. 分别用加样器头吸取各份标本，避免相互交叉使用。

5. 叠氮钠(NaN₃)对辣根过氧化物酶有灭活作用，在本实验系统中应避免使用。_­­

6. 底物显色液应在临用前配制，置4℃避光保存，H₂O₂应置2-8℃，保存6个月以内。加入底物显色15-30min后应立即测定OD值。

7. 应避免反应孔中有气泡，以免影响所测OD值的准确性。

8. 用不同来源的样品、不同实验室所测得的TNF-α含量不同，正常值标准也难于统一。可进行大样本测定，以X  2SD确定自己实验室各种来源检测样品的TNT-α正常值范围。一般ELISA法测定血清标本时，TNF-α参考值范围为4.3  2.8μg/L(或4.3 2.8ng/ml)。