大观霉素间接竞争性ELISA的建立及应用

大观霉素（spectinomycin，SPE）是一种氨基糖苷类广谱抗生素，是Mason于1961年首次从链霉菌中分离得到^[1]。从结构上讲，氨基糖苷类抗生素分子中均含有氨基糖苷结构。而SPE（图1）是一种氨基环醇类抗生素，没有氨基糖苷结构，但在许多文献资料中SPE都被归为氨基糖苷类药物。在临床中，SPE多采用盐酸大观霉素的形式，是常用的治疗猪的细菌性肠炎和鸡的呼吸道疾病的口服药^[2]。SPE常被用作畜禽饲料添加剂，用于治疗和预防疾病。与其他抗生素一样，SPE在畜禽养殖中被严重滥用，在动物体内蓄积，并通过食物链传递给人类，相当于长期低剂量的服用SPE，导致肌体内细菌的耐药性增加，进而破坏肌体的提抗力，引发过敏反应、听神经损害等。农业部“235”号公告明确规定了大观霉素在动物性食品中的残留限量为500 µg/kg，在牛奶中不得超过200 µg/L^[3]。GB 29685-2013规定检测动物性食品中大观霉素的方法是GC/MS ^[4]。

图1大观霉素化学结构式

Fig. 1 The chemical structure of spectinomycin

建立大观霉素残留快速检测方法具有重要意义。本研究在前期抗原抗体制备的工作基础上^[5]，建立了SPE的ELISA检测体系及其在动物源性食品中残留的检测方法，基于此项研究工作开发的检测试剂已实现商品化。

1 材料与方法

1.1试剂

大观霉素、庆大霉素、新霉素、卡那霉素、双氢链霉素、链霉素购自中国药品与生物制品鉴定所，羊抗兔酶标二抗、牛血清白蛋白（BSA）、Proclin 300、明胶、Tween-20、酪蛋白等购自sigma 公司；ELISA酶标板，深圳金灿华；新生牛血清购自北京元亨生物；其他分析纯化合物均购自北京国药集团。大观霉素包被抗原、大观霉素多克隆抗体由本公司制备。

ELISA所用的缓冲溶液：

（1）包被缓冲液：0.05 M碳酸盐缓冲液，pH 9.6；

（2） 磷酸盐缓冲液（0.02M，PBS）：1000 mL 0.01M PB缓冲液中加入8.5 g NaC1，0.02 g KCl，pH 7.4；

（3）洗涤液：1000 mL PBS加入0.5 mL Tween-20；

（4） 酶稀缓冲液：2 mL Tween-20、1 g明胶、200 mL新生牛血清（使用前56℃灭活30 min）、0.2 g酪蛋白和300 μL ProClin 300，加入到0.02 M PBS中，定容到1000 mL；

（5）封闭液：1000 mL PBS加入2.5 g酪蛋白、3%BSA、5%蔗糖和300 μL ProClin 300；

（6）抗体稀释液：0.01M PBS中加入300 μL ProClin 300、200 μL Triton 100、0.1% BSA，定容到1000 mL。

1.2 仪器

MK3酶标仪（美国，Thermo fisher公司）；TDL-40C离心机（上海安亭科学仪器厂）；HQ-60型涡动仪（北京方正生物科技发展有限公司）；电子分析天平（德国，赛多利斯科学仪器公司）；Milli-Q型超纯水仪（美国，Milli-Q 公司）；微量移液器（德国，Eppendorf公司）；SH-2 微孔板脱水仪（北京双和盛源科技发展中心）。

1.3 方法

1.3.1 建立大观霉素的标准抑制曲线  

首先，用方阵法筛选包被抗原、抗体的工作浓度，并对包被方式、加样体系进行选择，然后建立SPE的icELISA标准曲线：

（1）包被：根据方阵法确定的浓度稀释包被抗原，每孔100 μL，4℃过夜包被（16h），弃包被液，洗涤一次；

（2）封闭：在每孔中加入150 μL封闭液，室温下封闭2 h，弃封闭液，甩干；

（3）干燥：将甩干后的酶标板倒扣至于37℃恒温箱中，干燥1 h。

（4）加样：将50 μL不同浓度的SPE标准品平行加入微孔中，标准品浓度设置为：0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2 ng/mL。然后顺序加入50 μL酶标二抗工作液、50 μL SPE抗体，室温下（25±2℃），避光反应30 min，洗涤四次；

（4）显色：在每孔中加入按照同样比例刚混合的底物液100 μL，避光孵育8-10 min；

（5）读数：每孔加入50 μL终止液终止，5 min内在450 nm/630 nm 双波长下读出数据；

以SPE标准品浓度的对数为横坐标，不同浓度的SPE标准品的结合率为纵坐标，用软件Origin8.0绘制标准曲线，建立四参数回归方程。回归方程如下：

其中Y为结合率，A₁代表最低浓度标准品的结合率，A₂是最高浓度标准品的结合率，P为曲线拐点的斜率，X₀为IC₅₀。

1.3.2 抗体的特异性 

以icELISA法分别考察SPE抗体与氨基糖苷类抗生素：庆大霉素、新霉素、卡那霉素、双氢链霉素、链霉素的交叉反应，建立上述药物的标准抑制曲线，并计算各自的IC₅₀，按下式计算交叉反应：

交叉反应(CR％)=IC₅₀(SPE)／IC ₅₀(有关化合物)×100％

1.3.3  样本分析

1.3.3.1 牛奶样本

准确量取0.1 mL牛奶样品于2 mL离心管中，加入0.9 mL 含0.01% Tween-20的去离子水，慢速涡动混匀后取50 µL进行检测。稀释倍数：10。

1.3.3.2 组织样本

   准确称取1±0.01 g 均质后的组织样本（猪肉、鸡肉）于50 mL离心管中，加入5 mL 0.01M PBS，充分涡动1 min；4000 g离心10 min；取200 μL上清于新的离心管中，再加入400 μL 0.01M PBS，充分涡动20 s；取50 μL进行检测。稀释倍数：18。

2 结果

2.1 SPE标准抑制曲线

图2 SPE的标准曲线

Fig. 2  The standard curve for SPE by icELISA

对各种工作条件（包括抗原、抗体浓度，酶标二抗浓度、包被方式、抗体稀释液、加样体系、反应时间等）进行优化。根据IC₅₀和OD_max确定最佳工作浓度，总原则是选择使标准曲线IC₅₀值更低、OD_max范围在1.8~2.2的工作条件。图2是使用四参数拟合的SPE标准曲线，IC₅₀=1.78 ng/mL，R²=0.9926。

2.2   抗体特异性

本研究所用的SPE多克隆抗体与氨基糖苷类抗生素的交叉反应情况如表1，SPE抗体与其他氨基糖苷类化合物有轻微交叉，说明抗体的特异性强，可以特异的检测待测样本中SPE。

表1 SPE与结构类似物化合物的交叉反应率

Table 1  The cross-reactivity of SPE with related compounds

2.3   样本检测

2.3.1  确定检测限（LOD）

分别测定20份牛奶、鸡肉、猪肉样本的空白组织，取其测定平均值（X）加3倍标准差（SD），即LOD =X+3SD，计算SPE在牛奶、鸡肉、猪肉的LOD分别为4.8 µg/L、9.3 µg/kg和10.0 µg/kg。

2.3.2  添加实验

准确度和精密度是评价检测方法可靠性的重要指标，在ELISA工作中，准确度和精密度分别用回收率和精密度来评价。根据检测线性范围及检测要求，SPE在牛奶中的添加浓度为4.8 µg/L、9.6 µg/L，在鸡肉中的添加浓度为9.3 µg/kg、18.6 µg/kg，在猪肉中添加浓度为10 µg/kg、20 µg/kg。每种样品分别取三个不同批次，每个批次5个样本，按照本试验确定的ELISA方法检测并计算批内和批间的回收率及其变异系数。

表2 SPE在三种样本的回收率和变异系数

Table 2  The recoveries and coefficient of variation in the three samples of SPE

从表2可以看出，在牛奶、鸡肉、猪肉样品中添加不同浓度的大观霉素，批内添加回收率在77.1%至116.0%，批内变异系数在4.6%至9.7%，批间添加回收率在82.3%至118.2%，相应的批间变异系数在6.8%至12.3%。无论是批内还是批间，所有样本的添加回收率均在70%至120%之间，变异系数也都小于15%。结果表明新建立的检测SPE残留的ELISA方法在准确性和精密度上达到了兽药残留检测的要求^[6]。

1.3.3 与仪器分析比较

ELISA与GC/MS比较结果见表3。GC/MS条件：色谱柱，毛细管色谱柱Rtx-5，30m×0.25 mm；载气，氦气；柱流速：1mL/min；进样体积：1µL；进样口温度：280℃；扫描离子：145，171，187，201。

表3 IcELISA测定结果与GC/MS测定结果的比较

Table 3 The comparison of results determined by indirect competitive ELISA and GC/MS

GC/MS检测限是50 µg/kg（µg/L），这个浓度的SPE对于ELISA来说，还需要进一步稀释才能分析。牛奶样本需要稀释10倍，组织样本稀释5倍后应用于ELISA。由表3可知，经单因素方差分析，两种方法的分析结果无显著性差异（P＞0.05），进一步说明，本研究所建立的ELISA方法可用于牛奶及组织样品中SPE的检测。

3 讨论

本研究工作的目的是建立大观霉素的ELISA方法并将其应用于样本检测中。关于大观霉素免疫分析方法，国内外报道较少，但都局限于抗体制备及ELISA方法建立，没有关于应用性的研究报道^[1,5,7]。

研究过程中发现，反应时间的长短对最后的反应结果会有很大的影响。抗原-抗体的结合是一个动态平衡的过程，需要一定的反应时间达到所谓的“平衡”的状态。时间过则短体系还没有充分反应，这种情况下中断反应会使得反应结果太过依赖操作时间，重复性不好；时间过长虽然反应已充分，但过长的反应时间导致外界影响因素增多，使得反应出现不正常的平衡移动，从而干扰反应结果，影响检测的准确性。在本研究中，反应时间30 min时反应已达到平衡，此时反应灵敏度最高。随着时间的推移，灵敏度反而变小，因此选择反应时间为30 min比较合理。

为满足市场对快检产品的要求，本研究依靠高灵敏度的抗原、抗体，通过对各个条件进行优化，采用“一步法”（one-step），即标准品、酶标二抗、一抗按照顺序先后加入微孔板并进行孵育反应，而不是分成“标准品+一抗”、“酶标二抗”两步进行，减少了其中的洗板过程，简化了反应步骤，适应了市场对快检产品“快”的要求。

参考文献

[1]  Thacker, J. D., Casale , E. S., Tucker, C, M. Immunoassays (ELISA) for Rapid, Quantitative Analysis in the Food-Processing Industry [J]. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 2680-2685

[2]  Medina A B. Development of a Fluorescent Latex Immunoassay for Detection of a Spectinomycin Antibiotic [J]. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 3231-3236.

[3]  中华人民共和国农业部。GB 29685-2013 动物性食品中林可霉素、克林霉素和大观霉素多残留的测定  气相色谱-质谱法 [S]。2013-09-16。

[4] 中华人民共和国农业部。农业部235号公告：动物性食品中兽药残留最高限量[EB/OL]。http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/2002-12-24。

[5]  王照鹏，李向梅，王文珺等。大观霉素人工抗原的合成及其多克隆抗体制备[J]。中国畜牧兽医，2014，41（2）：54-57。

[6]  中华人民共和国农业部。农医发[2005]17号：兽药残留酶联免疫试剂（盒）备案参考评判标准[S]。2005-06-23。

[7]  曹馨匀，张云涛，杨福军等。大观霉素酶联免疫吸附检测方法的建立[J]。兰州大学学报（医学版），2009，35（2）：44-46。

文章来源：《动物医学进展》，2016,37(1):43-46