第三阶段 阳性相互作用的再次确定
材料
缓冲液和溶液
乙酸铵（7.5 ml/L)
氯仿
乙醇
异丙醇
裂解液
酶解酶 100T 以 2~5 mg/ml 溶解于拯救缓冲液中或β-葡糖醛酸酶 100000 单位/ml(Sigma）按 1:50 稀释于拯救缓冲液中每次使用均需配置新鲜的溶液。
酚（早衡至 pH8.0)
拯救缓冲液
50 mmol/LTris-Cl(pH7.5)
10 mmol/LEDTA
0.3%β-巯基乙醇
每次使用均需配置新鲜的溶液。
SDS(10%,m/V)
STES 裂解液
100 mmol/LNaCl
10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
1 mmol/LEDTA
0.1%(m/V)SDS
TE(pH8.0)
酶和缓冲液
限制性内切核酸酶 Eco RI，XtoⅠ，Hae Ⅲ
凝胶
琼脂糖凝胶
请参见步骤 5。
培养基
CM 选择培养基
利用表 18-3 估计所需培养基的量，并根据表 18-9 制备所需的选择培养基。
无氨基酸的酵母氮源（YNB) 分含或不含硫酸铵两类，均有销售。表 18-9 中假定 YNB 中含有硫酸铵。如果酵母氮源包装瓶上说明制备培养基需加 1.7 g/L 酵母氮源，那么它就不含有硫酸铵，配制时毎升培养基中应加入 5 g 硫酸铵。
含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板
细菌基本培养基（色氨酸缺乏）
制备下列高压灭菌贮存液：
1.20%(m/V）硫酸镁
2.4 mg/ml 尿嘧啶
3.4 mg/ml 组氨睃
4.4 mg/ml 亮氨酸
5.20%(m/V) 葡萄糖
制备下列过滤除菌溶液：
6.50 mg/ml 苄青霉素
7.1% 盐酸硫胺素
分别高压灭菌下列两种溶液：
8.15 g 琼脂溶解于 800 ml 蒸馏水中
9.10.5 g 磷酸氢二钾
4.5 g 磷酸二氢钾
1 g 硫酸铵
0.5 g 柠檬酸钠
160 ml 蒸馏水
将溶液 8 和 9 冷却至 50°C，混合。迅速加入 1 ml 的溶液 1.10 ml 的溶液 2，10 ml 的溶液 3，10 ml 的溶液 4,10 ml 的溶液 5,lml 的溶液 6，以及 0.5 ml 的溶液 7。彻底混合终溶液，马上倒制平板。
酵母选择 X-gal 培养基
i. 按照表 18-9 所述，在 900 ml 水中制备基础培养基，高压灭菌后冷却至 55°C
ii. 在另外一个瓶子中，7 g 磷酸氢二钠和 3 g 磷酸二氢钠溶于 100 ml 蒸馏水中, 高压灭菌。
iii. 把两种高压灭菌溶液混合在一起，加入浓度为 100 mg/ml 的 X-gal 溶液（溶于 N,N-二甲基甲酰胺）0.8 ml, 倒制平板。
离心机和转子
Sorvall RT6000 离心机，H1000B MPC 和 H6000A MPC 转子（离心微量滴定板用）
专用设备
玻璃珠（直径 0.45 mm, 无菌；Sigma)
微量滴定板（24 孔或 96 孔 [可选])
重复用移液管
可选，请参见步骤 1。
附加试剂
此方案的步骤 2 需要第 1 章方案 26 中列出的电穿孔试剤。
此方案的步骤 3 和 4 需要第 1 章方案 1 中列出的小量质粒 DNA 制备用试剂。
此方案中步骤 10 需要第 4 章方案 13 中列出的酵母 DNA 测序试剂。