双缩脲法测蛋白质中该如何校正实验结果

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红色复合物。而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与铜离子形成紫红色配位化合物，其最大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适用于1~10mg/mL，双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。

①双缩脲法：A540-蛋白质浓度标准曲线

②紫外吸收法：A280-蛋白质浓度标准曲线
实验操作：
取双缩脲试剂、10mg/mL的标准蛋白溶液和待测蛋白溶液（稀释10倍的人血清），按下表配制6支溶液：

紫外吸收测定法
目的要求：
了解紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
掌握紫外分光光度计的使用方法。
实验原理：蛋白质分子中所含酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质在280nm 波长处有最大吸收值。在一定浓度范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此。广泛应用在柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。此法的缺点是∶①对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差;②若样品中核酸等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但是可作为初步定量的依据。该法可测定蛋白范围应在0.1～1.0mg/mL。
试剂和器材：1.标准和待测蛋白质溶液（1)标准蛋白溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成1mg/mL蛋白溶液。（2)待测蛋白质溶液：人血清，使用前稀释100倍。2.器材
试管1.5cmx15cm(x9);试管架；移液管1mL(x3),2mL(x2),5mL(x2);分光光度计。
操作方法：1.制作标准曲线

取8支试管编号，按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
注意事项：
由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。此外，蛋白溶液中存在核酸或核苷酸时也会影响紫外吸收法测定蛋白质含量的准确性。
三、标准曲线的绘制与蛋白质的浓度计算
曲线如上图①，②。
双缩脲法：所配制溶液（0.5mL十倍稀释血清被稀释成1mL）蛋白质浓度为4.27mg/mL，稀释10倍的血清中蛋白质的浓度为4.27*2mg/mL，原血清中蛋白质浓度为4.27*2*10=85.4mg/mL。
紫外吸收法：所配制溶液（1mL稀释百倍血清被稀释成4mL）蛋白质浓度为0.377mg/mL，稀释100倍的血清中蛋白质的浓度为0.377*4mg/mL，原血清中蛋白质浓度为0.377*4*100=150.8mg/mL。
四、结果分析与讨论
用双缩脲法测定的血清中蛋白浓度为85.4mg/mL，用紫外分光光度法测定的血清中蛋白浓度为150.8mg/mL。结果相差较大，现讨论如下：
双缩脲法的原理为铜离子与蛋白质形成有色复合物显色，受非蛋白物质影响小，而且其结果接近人血清中蛋白浓度正常范围60-80mg/mL，结果较为可信；而紫外吸收测定法测定人血清远超正常范围，准确度很低。经查阅相关文献资料，发现当样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质，在280 nm 处来测量蛋白质含量时，会有较大的干扰，即增大吸收度，使得测定的蛋白质浓度偏大，人血清样品含较多核酸类物质，符合此描述，可以认为是人遗传物质带来的干扰。再次查阅文献资料得知，要减小核酸类物质对蛋白质浓度的测量的干扰，需要利用核酸在 260 nm 处的光吸收比 280 nm 更强，而蛋白质与此相反的性质，利用 280 nm 及 260 nm 的吸收差来计算蛋白质的含量，相应的也形成了校正表，具体测算时应当对照校正表计算。
五、思考题
干扰双缩脲法测定蛋白质浓度实验的因素有哪些？①样品中自带的类脂及色素干扰比色。②不同碱性条件下蛋白质浓度线性相关性不同。③硫酸铵，EDTA，一些氨基酸等干扰铜离子的反应。
（2）紫外吸收测定法测定蛋白质含量时，若样品中含有核酸类杂质，应当如何校正实验结果？①用离子层析柱进一步提纯样品，减少样品中核酸类物质含量。②可以使用查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正以减少核酸的干扰，但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。