反向PCR

噬菌体 T4 连接酶 限制性内切核酸酶 热稳定 DNA 聚合酶 寡核苷酸引物 模板 DNA

扩增缓冲液 ATP 氯仿 dNTP 贮存液 乙醇 酚 氯仿 乙酸钠 TE Tris-Cl

琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶 屏蔽型枪头 离心管 正向排液式移液器 PCR 仪

一、材料

1. 缓冲液与溶液

10X 扩增缓冲液

ATP ( 10 mmol/L )

氯仿

4 种 dNTP 贮存液（20 mmol/L，pH 8.0)

乙醇

酚：氯仿（1：1，V/V)

乙酸钠（3 mol/L）

TE ( pH 8.0)

Tris-Cl (10 mmol/L，pH 7.6)

2. 酶与缓冲液

噬菌体 T4 连接酶（1 单位/μl）

限制性内切核酸酶

热稳定 DNA 聚合酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶

4. 核苷酸与寡核苷酸

寡核苷酸引物1 ( 20 μmol/L) 和寡核苷酸引物2 ( 20 μmol/L）溶于水中

模板 DNA 溶于 10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)，内含少于 0.1 mmol/L EDTA

5. 特殊设备

自动微量移液器的屏蔽型枪头

离心管（0.5 ml，薄壁扩增反应专用离心管）

正向排液式移液器

PCR 仪

二、方法

1. 设计和合成寡聚核苷酸引物 1 与引物 2 是根据已知的 DNA 序列。

2. 消化 2~5 μg DNA 模板（序列复杂度小于 10⁹ bp）应用适当的限制性内切核酸酶。抽提这种酶切消化的 DNA 样品，应用酚: 氯仿和氯仿各抽提样品一次；用 2.5 倍体积的乙醇沉淀 DNA 样品，再加 0.1 倍体积的 3 mol/L 乙酸钠；高速离心回收沉淀的 DNA 样品；沉淀用 TE ( pH 8.0) 溶解，使 DNA 样品的浓度为 100 μlg/ml。

3. 用一只 0.5 ml 灭菌离心管、扩增管或灭菌微量滴定板，依次加入以下连接反应试剂，内含浓度范围在 0.1~1 μg/ml 的酶切消化的模板 DNA 样品：

模板 DNA                                     10 ng~100 ng

10X 连接缓冲液                            10 μl

1 单位/μl 噬菌体 T4DNA 连接酶      4 μl

10 mmoI/L ATP                             10 μl

H₂O 补足至                                  100 μl

反应管在 16℃ 水浴上放置 12~16 h。

4. 用酚: 氯仿和氯仿备抽提连接反应液 DNA 样品一次。用 2.5 倍体积的乙醇和 0.1 倍体积的 3 mol/L 乙酸钠沉淀 DNA 样品。用高速离心回收沉淀的 DNA 样品，用 10 mmol/L Tris ( pH 7.6) 或水溶解 DNA 样品。浓度配制成 100 μg/ml。

5. 用一只 0.5 ml 薄壁离心管，依次加入如下试剂，混合：

10X 扩增缓冲液                                      5 μl

20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液（pH 8.0）  1 μl

20 mmol/L 寡核苷酸引物1                       2.5 μl

20 mmol/L 寡核苷酸引物2                       2.5 μl

1~5 单位/μl 热稳定 DNA 聚合酶              1.0 μl

H₂O                                                      28~33 μl

已环化 DNA 模板                                   5~10 μl

总体积                                                  50 μl

6. 如果 PCR 仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层加一滴矿物油（约 50 μl）防止样品在 PCR 反应多个加热与冷却的循环过程中蒸发。另一种方法是，如果应用热启动 PCR 程序，在反应混合液的上层加一层石蜡油。放置扩增离心管或微量滴定板在 PCR 仪上。按以下方法进行 PCR 扩增。典型的程序有变性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度列表如下：



7. 抽取每种扩增样品 5~10 μl，用琼脂凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析扩增结果，用 DNA marker 来判断扩增片段的大小。凝胶一般用 EB ( 溴化乙锭）或 SYBR 金颗粒染色后来观察扩增的量与片段大小。