反转录病毒产毒细胞系建立实验——测定病毒滴度

病毒原液

G418

离心机培养箱

1.  感染的前1天按1：10至1：20将靶细胞NIH 3T3分传于6 cm 培养皿中。

2.  进行感染的当天，移去靶细胞的培养液，加入含有病毒原液的培养液。用1~2 ml 含 有0.01 μl~0.1 ml 病毒原液的培养液感染6  cm 培养中的细胞，或3~5 ml 感染10 cm 培养皿中的细胞。对于鼠源性的或禽源性的E亚群，加800 μg/ml 的polybrene至终浓度8 μg/ml，在37℃温育细胞1~3 h。

3.  用培养液稀释polybrene至2 μg/ml，并培养至少2或3个细胞周期。

4.  如果病毒携带了一个组织化学标记基因如lacZ则感染的细胞可用Xgal染色，不需要进行药物选择。计数蓝染的细胞，接着按步骤7计算滴度。

5.  如果病毒携芾了药物抗性基因，将感染的细胞分传入选择培养液中。如果抗性基因是neo将细胞按1：10至1：20传代，分传入2个各含有G418的10 cm 的培养皿中，培养3天。

6.  换液，内含适当的选择药物。共培养7~10天，届时应可见到细胞克隆。在克隆扩散之前计数其数目

7.  按如下公式计算滴度（RCFU表示抗性CFU）

或，如果病毒携带lacZ基因，

粗略的估计是，病毒滴度的变化大于3倍即为有显著差异。

8.  用一种分析方法证明产病毒克隆所产生的病毒没有发生重排或丟失。