反转录聚合酶链反应（RTPCR）诊断禽流感

近年来发展的RTPCR分子诊断技术具有高度的敏感性和特异性，可大大缩短对AIV病毒的检出时间，克服了传统的禽流感诊断技术的缺点，为禽流感早期快速诊断提供子敏感、快速、实用的方法。1986年，Perdue用聚合酶链反应（PCR）诊断禽流感，从接种鸡胚到出结果仅用时36h。

赵建梅等在传统一步法RT-PCR扩增各种病毒RNA的基础上，进行了两种病毒和三种病毒的一步法多重RT-PCR的试验，认为此检验方法在实际工作中也有较大的使用价值。一步法多元-PCP,是指在一个PCR反应体系中同时设立2对或2对以上引物，用于扩增不同的目的片段。目前这种方法可以同时检测流感病毒的型和亚型。S．K．Poddar将67份样品分成两部分，一部分用一步法多元PCR检测，另一部分用已经建立好的单抗ELISA方法检测，结果两种方法之间有很好的吻合率。

E．Starick认为，用RT-PCR方法可以鉴别高低致病力AIV。而C．Steininger认为RT-PCR技术的灵敏度要高于病毒分离和ELISA，可以避免一些错误的阴性结果。B．Herrmann报道用巢式RT-PCR同时检测A、B流感，从215份流感疑似病料中，巢式RTPCR检出8份，病毒分离检出66份，免疫荧光检出68份阳性结果。E．Starick报道，设计了一个H7亚型特异性的巢式RT-PCR，扩增片段包括了血凝素裂解位点，可以依据裂解位点变化确定强弱毒株，他认为该方法与病毒的分离鉴定具有同样的灵敏性，检出率更高。

Y，Pang和M．LKhan等设计了分别针对鸡传染性支气管炎病毒（1BV）、传染性喉气管炎病毒（1LTV）、新城疫病毒（NDV）、鸡毒支原体（MG）、鸡滑液囊支原体（MS）和AIV 6对引物进行的多重PCR反应。在用琼脂糖凝胶进行检测35轮PCR产物时发现检出的敏感度DNA或RNA的量对IBV、AIV、MG和ILTV为long左右，对NDV和MS为100ng左右。该方法也适用于各种病原的混合感染时的病料。

国内谢芝勋等参考禽流感病毒M基因和HA基因序列设计了3对引物，其中1对为针对不同HA亚型AIV的通用引物，另外2对为分别针对H5和H7亚型的特异性引物，通过对多重RT-PCR扩增条件的优化‘，成功建立了快速检测鉴别AIV H5、H7亚型的多重RT-PCR方法。该多重RT-PCR特异性好，对AIV不同亚型RNA的zui低检测量为10pg，对AIVH5和H7亚型RNA的zui低检出量为100pg。不需要对病原体进行分离增殖，就可对临床疑似AIV感染的样品或环境样品进行直接检测鉴别，避免了进行AIV分离增殖过程中散毒和传播等风险。该多重RT-PCR快速检测鉴别AIVH5、H7亚型技术的建立，对AIV高致病性H5、H7亚型感染的诊断及制定有效的防治措施具有实用价值和指导意义。