变性凝胶电泳实验

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乙醇 异丙醇 二甲基二氯硅烷 TEMED 变性丙烯酰胺溶液 SDS

电泳仪 注射器 巴斯德吸管 干胶机

1.  制作每块凝胶时，首先要用肥皂及水小心严格地清洗两块30 cm×40 cm的前后玻璃平板，用去离子水冲洗后晾干，用喷射洗瓶喷10%乙酵或异丙醇使平板湿海。

2.  然后用Kimwipe纸或其他无绒纸巾将平板擦干。

3.  戴手套在通风橱工作，用浸湿了含5%二甲基二氯硅烷的氯仿溶液的Kimwipe纸在每片平板的其中一面加一层此溶液，并小心洗擦拭整面平板。

4.  待硅化层干后，用Kimwipe纸以70%乙醇或异丙醇擦净并干燥，最后再检查平板有没有灰尘或其他物质。

5.  按厂商指南用0.2~0.4 mm 均厚的垫片和大的书本装订夹子组装凝胶胶模夹层，注意垫片与平板的边、底压紧对齐。

6.  制作每块凝胶时，在100 ml 烧杯配制60 ml 所需的变性丙烯酰胺凝胶溶液，在灌胶（步骤7）前，彻底混匀60 μl TEMED和0.6 ml 10%过硫酸铵于每份丙烯酰胺溶液中。

7.  立即灌胶，用60 ml 注射器小心吸出丙烯酰胺溶液，避免吸入气泡，让短平板朝上， 并使凝胶平板夹层与臬面成45度角，沿着平板的一边慢慢将丙烯酰胺溶液推入两片平板之间，其间可调整角度让胶液慢馒流入夹层的一边。

8.  当溶液达到短平板的顶部时，放下胶模夹层至其顶部边缘离操作台平面仍有5 cm 左右，其下垫一空的吸头盒或其他物件以使之保持较低的角度。

9.  将0.2~0.4 mm 厚的鲨鱼齿样品梳的平齐一侧插入胶液中，至短平板下约2~3 mm，操作须十分小心以避免产生气泡，用一个书本装订夹将平极之间的样品梳夹紧，以避免在掩子与平板间形 成凝胶固块。

10.  加一层过量的丙烯酰胺溶液至梳子，保证其被完全覆盖。用水冲洗注射器，除去过量的丙烯酰胺。

11.  除去每片胶模夹层的底部垫片或胶带，用刀片除去样品瓶周围的过量聚丙烯酰胺凝胶。

12.  用水清洗平板表面溢出的尿素和丙烯酰胺溶液，从每片胶模夹层中拨去鲨鱼齿样品梳，避免拉伤凝胶顶部。

13.  用水清洗梳子，准备好在步骤16操作时重新插回样品孔。如果用常规样品梳，小心防止撕裂聚丙烯酰胺加样孔，

14.  凝胶电泳装置的下层贮液槽加入1XTBE缓冲液，使凝胶夹层能浸泡在2~3 cm 的一层缓冲液中，放入凝胶夹层并用夹子固定在电泳装置上。

15.  上层贮槽倒入1×TBE缓冲液，使超过凝胶顶部约3 cm，用巴斯德吸管或Beral细管以1×TBE清洗凝胶顶部。

16.  将清洗干净的鲨鱼齿样品梳重新播回凝胶夹层，使其齿部仅可触及凝胶，用巴斯德吸管或Beral细管以1×TBE缓冲液彻底清洗加样孔，以除去零星的聚丙烯酰胺碎片。

17.  加样前，在45 V/cm 凝胶的电压降下预电泳，使凝胶预热，即在1 700 V，70 W 恒功率下电泳约30 min。

18.  在加样前，清洗加样孔除去浸进孔中的尿素。

19.  在甲酰胺/染料溶液中的样品，盖好盖子，在95℃加热2 min，然后置于冰上，每孔加 样2~3 μl 测序用的加样吸头可于每次加样后在下槽缓冲液中冲洗2次后继续使用。

20.  在45~70 W 恒功率下电泳，凝胶温度保持在约65℃。

21.  高于此温度可能会造成玻璃平板炸裂或条带弥散，而太低温度可使测序产物不完全变性、现察标志染料的迁移以确定电泳时间。

22.  将干冰加入干胶机的冷阱并预热至80℃。

23.  电泳完毕时，排出上下液槽的缓冲液，并按放射性废物处理丢弃液体。

24.  从电泳装置中取出凝胶夹层，并在冷自来水下冲洗直至两面玻璃平板表面都冷却为止，将夹层平放在纸巾上，四口玻璃平板（短平板）朝上，除去多余的液体及夹子、胶带，取出一边的垫片。

25.  两片玻璃平板之间插入一个长金属铲子，轻轻转动铲于将玻璃 平板橇起使之分开，凝胶应贴在下面的玻璃平板，如果贴在上面的平板，则将它翻转过来。

26.  从插有铲子的一边馒慢提起上面的平板，遂渐增加角度直至上层平板完全与凝胶分离。

27.  一旦平板分离后，取去另一边的垫片及除去凝胶周围多余的聚丙烯酰胺碎片。

28.  如果样品含³²P或³³P，固定步骤可用可不用。如果样品含³³S，直接将凝胶连同玻璃平板一起放入浅托盘中，轻轻覆盖一层约2 cm 的5%乙酸 / 5%甲醇固定液，浸泡10~15 min，不时轻轻摇动托盘使凝胶与玻璃平板松开。

29.  将疑胶重新置于平板上，靠吸力或重力除去固定液注意保持凝胶处于平极的中央， 小心从托盘中将平板连同凝胶取出，放在工作平台上。

30.  将两张干的转印纸，叠齐如 同一张一祥，从凝胶的一端开始缓慢地向另一端放下，贴在凝胶的表面，小心防止在纸和凝胶间形成气泡。

31.  从平板上剥起转印纸，凝胶应和它一起被揭起，逐渐卷起纸，而凝胶就同它一起被剥离平板。

32.  将滤纸和凝胶放在预热的干胶机中，上面覆盖一张保鲜瞑，80℃处理20 min ~1 h，使凝胶彻底干燥。

33.  从干胶上揭去保鲜膜，将干胶放在X光曝光盒中，Kodak XAR-5X光胶片直接与凝胶接触，室温放射自显影，经足够时间曝光后（一般需过夜）取出X光胶片并冲印。

变性聚丙烯酰胺凝胶中相对于示踪染料的寡核苷酸的迁移