口蹄疫分子生物学诊断技术

近年来，由于分子生物学技术的迅速发展及其在FMD诊断中的应用，建立了各种FMD的分子生物学诊断技术，主要包括以下几种方法，核酸杂交、等电点聚焦电泳、寡核苷酸指纹图谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚合酶链式反应、单克隆抗体技术等。

（1）核酸探针 核酸探针即应用FMD的cDNA克隆片段，用32P或生物素等标记后制备探针，根据标记片段的不同，可以检测各群（群特异性探针）或某一型（型特异性探针）FMDV的RNA，如McFarlance等的报道。应用A12亚型的全基因组cDNA以及O1型、C1型和Asial型的VPl基因片段制备核酸探针，前者可以检出O型、A型、C型和Asial型FMDV，而后者则可分别检出各自相对型的FMDV。国内学者吴时友、杨永钦等报道应用cDNA探针成功检出FMDV，随着PCR技术的建立极大地方便了核酸探针的制备和应用。只要正确选用恰当的核酸片段，完够制备群特异、型特异的核酸探针检测FMDV的RNA。1998年Rossi和Sadir等用’’P标记克隆在质粒上的FMDV基因组聚合酶序列作为探针，对试验感染牛的食道／咽部刮取物进行了检测，认为此法为进出口动物FMD检疫提供了快速、准确的检测方法。利用固相杂交检测和区分FMDV，利用核酸探针检测FMDV持续感染细胞的病毒RNA也有不少报道。核酸杂交分析方法已经不再应用为FM—DV的诊断方法，与PCR方法相比它灵敏度与特异性均较低，但作为阐述持续性感染的（细胞基础）核酸杂交分析方法则依然具有一定的作用。

（2）电聚焦 电聚焦是根据等电点的不同来分离像蛋白质这样的两性电解物。FMDV的结构和成分比较简单，完整的病毒粒子（1468）衣壳由lA（VP4）、lB（VP3）、1C（VP2）和1D（VPl）4种结构蛋白组成。在电聚焦技术中，FMDV诱导的肽都能聚焦清晰，通常是单一的区带，而且成熟多肽数量少，能产生单一的电聚焦型，可在单向电聚焦时与其他病毒带对照比较。因此，电聚焦技术在FMDV流行病学研究中具有较大的运用潜力，常被用于FMDV病毒株的遗传变异分析，以及特异型别研究中。在研究FMDV突变的物理图、病毒诱导的前体蛋白与zui终产物的相互关系、病毒的遗传重组、测定蛋白的分子质量、病毒的演化、毒株的鉴定、病毒的分类、肽的指纹图、蛋白的二级修饰等方面，等电点聚焦电泳技术均得到了应用。

（3）核酸序列分析 将RT-PCR与核酸序列测定相结合而成的核酸序列分析方法，在FMDV研究中已得到日益广泛的应用。Beck等将欧洲当时FMD暴发中分离的流行毒株与20年前分离并作为疫苗株的9株病毒VPl基因序列进行比较分析（FMDV的VPl蛋白能刺激机体产生中和抗体，起着重要的抗原作用），结果表明大多数毒株同疫苗毒株关系密切，因而推测大多数欧洲暴发的FMD并不是外部传人的，而可能是甲醛灭活不彻底引起的。他通过对核酸序列分析与其他方法的优缺点比较，建议把核酸序列分析作为一种标准的诊断方法。近年来核酸序列分析方法在FMD中主要用于疫源追踪、毒型鉴定和毒株的遗传学系统树分析。

（4）寡核苷酸指纹图谱分析 1981年King和Underwood等应用此方法比较了1981年英国流行的FMDVO型Jexsey和Wight岛毒株，同期法国流行的O型Brittany和Normandy毒株与疫苗毒株Lausanne和其他有关的奥地利、印度、泰国毒株间的寡核苷酸指纹图。

（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（PAGE） Harris和Brown用聚丙烯酰胺凝胶电泳对FMDV南非I型强毒株和弱毒株进行了生物化学分析。在不同毒株的比较和抗原变异方面也有应用。

（6）单克隆抗体技术（McAb） 仔细地选择单克隆抗体可以替代实验中的多克隆血清。在FMDV抗原位点的研究、抗原关系的研究、诊断和检疫方面都有应用。另外，近几年来也开展了抗独特型抗体在FMD的免疫、诊断和治疗方面的研究工作。