向平末端DNA连接合成接头实验

T4 噬菌体连接酶 T4 噬菌体多聚核苷酸激酶 限制性内切核酸酶 外源或目的 DNA 片段

乙酸胺 ATP 乙醇 10X 接头激酶缓冲液 MgCl2 二硫苏糖醇（DTT) 牛血清白蛋白 苯酚 氯仿 乙酸钠 TE

10% 聚丙烯酰胺凝胶 或 0.7% 琼脂糖凝胶

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙酸胺（4 mol/L，pH 4.8)，ATP ( 5 mmol/L 和 10 mmol/L)（如果连接缓冲液中已有 ATP，则在步骤 2 中省去添加 5 mmol/L ATP），乙醇，10X 接头激酶缓冲液（600 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6），100 mmol/L MgCl₂，100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT)，2 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）），苯酚：氯仿（1:1，V/V)，乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2)，TE ( pH 8.0)。

2. 酶和缓冲液

T4 噬菌体连接酶，T4 噬菌体多聚核苷酸激酶，限制性内切核酸酶。

3. 凝胶

10% 聚丙烯酰胺凝胶，或 0.7% 琼脂糖凝胶。

4. 核酸和寡核苷酸

外源或目的 DNA 片段（平末端），人工合成的接头，TE 溶解，浓度为 400 μg/ml。

5. 放射性标记物

[ y-³²P] ATP（1~10 μCi）。

6. 专用设备

柱旋转层析装置，温度可调至 65℃ 的水浴装置。

二、方法

1. 接头的磷酸化（如需要）

(1) 在一个无菌的 0.5 ml 离心管中加入下列反应混合物：10X 接头激酶缓冲液 1.0 μl，10 mmol/L ATP 1.0 μl，人工合成的接头 [ TE ( pH 8.0) 溶解 ] 2.0 μg，H₂O 补至 9 μl，T4 噬菌体多聚核苷酸激酶 10 单位，12 个碱基的接头约 250 pmol，反应物于 37℃ 温育 1 h。

如有必要，此时应进行目的 DNA 内部酶切位点的甲基化。甲基化处理按销售者的指导在连接接头之前完成。

2. 磷酸化接头与 DNA 平末端的连接

(1) 计算 DNA 平末端在制备物中的浓度，然后在一个 0.5 ml 离心管中加入下列连接反应混合物：50 μg 的 1 kb 长双链 DNA 片段=78.7 nmol 或 157.4 nmol/L 的末端；平末端 DNA 2 pmol 末端；磷酸化接头 150~200 pmol 末端；H₂O 补至 7.5 μl；10X 连接酶缓冲液 1.0 μl；5 mmol/L ATP 1.0 μl；T4 噬菌体 DNA 连接酶 1.0 Weiss 单位。

反应混合物于 4℃ 温育 12~16 h。

(2) 反应混合物于 65℃ 温育 15 min 以灭活 T4 噬菌体 DNA 连接酶。

(3) 让连接反应混合物冷至室温，然后加入：10x 内切酶缓冲液 10 μl；限制性内切核酸酶 50 单位；灭菌水补至 100 μl。

反应物于 37℃ 温育 1~3 h。

3. 连接产物（DNA）的回收

(1) 用苯酚：氯仿抽提纯化出酶切 DNA 片段，然后加乙酸胺（终浓度为 2 mol/L)，再加 2 倍体积的乙醇以沉淀 DNA。

(2) 于 4℃ 用微量离心机高速离心 15 min 收集 DNA 沉淀，加 50 μl TE ( pH 8.0) 溶解沉淀。

(3) DNA 溶液通过离心层析柱以除去过量的接头。

(4) 用乙醇沉淀回收 DNA，而后用 10~20 μl TE ( pH 8.0) 重新溶解沉淀。

经过修饰的 DNA 片段现在可以连入质粒（或噬菌体）载体（它们凸出末端与 DNA 片段由接头引入的序列互补）。