哺乳动物细胞基因稳定转染的实验

哺乳动物细胞

完全培养液

培养箱 离心管

1.  确定所要转染的细抱系能呈独立集落生长。对于贴壁细胞，在10 cm 组织培养培养皿中接种约100个细胞，培养10~12天，毎4天换液1次。亚甲蓝染色后对成活的细胞集落进行计数。

2.  确定母代细胞的选择条件：将一培养皿上生长汇片的细胞按不小于1：15的比例分传于含有不同药物浓度的培养液中。培养10天。用合适的选择培养液每4天换液1次， 并检查活细胞。

3.  确定转染母代细胞的最有效的方法。可选用磷酸钙或电穿孔方法。对于磷酸钙转染，在加DNA的前1天，将母代细胞按1：15分传中完全培养液中。

4.  用目的基因转染母代细胞，含目的基因的质粒与含标记基因的质粒的摩尔比例不小于5：1。用担体DNA替代含有目的基因的质粒作为对照，分别进行几次转染。
 

5.  在无选择条件下让细胞倍增2次。将细胞按1：15分传于选择培养液中。

6.  在选择培养液中接种5个以上培养皿，以得到尽可能多的能挑取和扩增成细胞系的细胞集落数，每4天用选择培养液换液，培养10~12天，将培养皿对着光成一角度观察其中的细胞克隆，其中的一只培养皿直可进行染色以便于计算细胞集落数。挑取大的、生长良好的细胞集落。

如果用5：1的比例，没有必要在转染前将透择标记基因与目的基因连接起来：如果选择需要用大量的选择性质粒，有时无态保证5：1比例，故要将选择标记基因及所要研究的目的基因构建在同一个质粒中。如果用含有所研究的基因进行转染没有形成克隆，而在含有的对照中却可产生究隆，则所研究的基因能有细胞毒性。