哺乳动物细胞胞质RNA的分离

冰冷的磷酸盐缓冲液 NaCl KCl Na2HP04•7H20 KH2PO4 冰冷的裂解缓冲液： LTris-HCl    NaCl   MgCL2   NkmidetP-40 胎盘  RNase 抑制剂  SDS 蛋白酶 K 酚 氯 仿 异戊醇   乙酸钠 (DEPC  处理）  无水乙醇 乙醇   乙酸钠   DEPC处理的水

Beckman JS 4. 2 转子或其他类似设备

一 材料与设备

1) 冰冷的磷酸盐缓冲液 (PBS):137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/l KCl,4.3 mmol/l Na2 HP04•7 H20,1.4 mmoI/L KH2PO4pH7.3

2) 冰冷的裂解缓冲液：50 mmol/LTris-HCl,pH 8.0 l00 mmoL/L NaCl,5 mmoL/L MgCL₂), 0.5%(V/V)NkmidetP-40 1000 U/ml 胎盘,RNase 抑制剂 (如：RNasin) 及 1 mmol/LDTT，用 DEPC 处理的水配制，过滤除菌

3)20%SDS

4)20 mg/ml 蛋白酶 K

5) 酚：氯仿：异戊醇 (25:24:1)

6)3mol/L 乙酸钠 (DEPC 处理）pH 5.2

7) 无水乙醇

8)75% 乙醇/25%0.lmoL/L 乙酸钠，pH 5.2

9)DEPC 处理的水


二 操作方法

1) 收集细胞：①对于贴壁细胞，每 10 cm 的培养皿用 Iml 冰冷的 PBS 洗三次，再以小体积的 PBS 刮下细胞并转移到离心管中 (置于冰丄）300 g 离心 5 min 去上淸，冰上放置。

②对于悬浮细胞，以 300 g 离心 5 min 收集细胞，去上清。再用一半体积冰冷的 PBS重悬细胞，按前述方法离心并去上清。

2) 以 375ul 冰冷的裂解缓冲液重悬细胞，冰上孵 5 min。在_4℃ 用微型离心机离心2 min 上清转移至一装有 4ul20%SDS 的管中,立即振荡混匀。

3）加人 2.5ul20 mg/ml 的蛋白酶 K,37℃ 温育 5 min

4) 加人 400ul 酚：氯仿：异戊醇，振摇 Imin。离心，上层水相转移至一干净管中，重复抽提一次，再用 400ul 氯仿：异戊醇抽提一次. 上: 层水相转移至一干净管中。

5) 加人 40ul3mol/l 乙酸钠 (pH5.2) 和 lml 无水乙醇, 混合，冰上沉淀;15〜30 min 或一 20℃ 沉淀过夜。

6) 于 4℃ 以 1200 g 离心 15 min。再用 1 ml75% 乙醇/25½0.lmol/1 乙酸钠(PH5.2) 洗涤沉淀。干燥后溶于 100ulDEPC 水中。取出一小份测定其浓度及纯度，其余负 70℃ 保存

1 ) 此方法一次可处理 2 X10⁷ 个细胞，每 10⁷ 个细胞可获得 30〜100ug  RNA 。其 A_260/080 应该在 1. 7〜2 . 0 之间。

2 ) 第二步操作重悬细胞时要小心操作，避免起泡沫,, 待悬液迅速变清，则显示细胞裂解完成

3 ) 如果所收集的细胞转染过 DNA，可用无 RNase 的 DNase  I  消化去掉污染的DNA , 再按前述的方法用酚：氯仿：异戊醇及氯仿：异戊醇抽提回收 RNA 。