噬菌体展示技术研究RNA结合蛋白实验（一）

实验方法原理 噬菌体展示技术是将外源基因与噬菌体的表面蛋白基因融合，在融合了外源基因的噬菌体颗粒的表面就会表达相应的外源蛋白，即外源基因编码的蛋白被展示在噬菌体颗粒的表面。

实验材料 载体tRNA抗体寡核苷酸

试剂、试剂盒 抗生素储存液BCIP葡萄糖储存液X-Gal磁珠洗液蛋白酶抑制剂RNase 抑制剂TENT 结合缓冲液印迹缓冲液牛血清白蛋白考马斯亮蓝染液丙烯酰胺凝胶配制缓冲液电泳缓冲液乙酸钠

仪器、耗材 顶层琼脂LBYT顺磁珠和磁架干胶装置及玻璃纸核酸电泳装置体外转录试剂盒

实验步骤

一、材料与设备

所有操作中使用的均为蒸馏过的去离子水。

1. 载体：pDISPLAYblue B；宿主菌：DH12S（Gibco BRL 公司）；辅助噬菌体：M13K07（Gibco-BRL 公司）。

2. 抗生素储存液（1000X）：氨苄青霉素（100 mg/ml，水溶液）；卡那霉素（70 mg/ml，水溶液）；甲氧苯青霉素（200 mg/ml，水溶液）。过滤除菌后分装，-20℃ 保存。

3. 培养液/基：

LB：10 g 蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl，加水定容至 1 L，铺板时加 15 g 琼脂粉，高压灭菌。

顶层琼脂：每升 LB 培养液中加 7 g 琼脂粉，高压灭菌。

2X YT：16 g 蛋白胨，10 g 酵母提取物，5 g NaCl，加水定容至 1 L，高压灭菌。

4. 培养液添加试剂：

BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，Sigma 公司），用二甲基甲酰胺溶解，配成 40 mg/ml 储存液，-20°C 保存。

葡萄糖储存液：20% (m/V) 葡萄糖水溶液，过滤除菌。

X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopy-ranoside），用二甲基甲酰胺溶解，配成 40 mg/ml 储存液，-20°C 保存。

5. 磁珠洗液 1：0.1 mol/L NaOH，0.1 mol/L NaCl。

磁珠洗液 2：0.1 mol/L NaCl。

6. 顺磁珠和磁架：Dynabeads M-280 链亲和素磁珠（Dynal 公司）。

7. PEG/乙酸铵：20% PEG8000，3.5 mol/L 乙酸铵。

8. 蛋白酶抑制剂：

苯甲基磺酰氟（PMSF）：100 mmol/L（乙醇溶解）储存液，-20℃ 保存，工作浓度为 500 μmol/L。

抑胃酶肽（pepstatin）：1 mg/ml（甲醇溶解）储存液，4℃ 保存，工作浓度为 0.7 μg/ml。

亮抑蛋白酶肽（Lcupeptin）：1 mg/ml（水溶解）储存液，-20℃ 保存，工作浓度为 0.5 μg/ml。

9. RNase 抑制剂（RNasin，Promega 公司）。

10. TE：10 mmol/L Tris-HCI（pH 8.0），1 mmol/L EDTA，高压灭菌。

11. TENT 结合缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA，250 mmol/L NaCl，0.5%（V/V）Triton X-100。

12. tRNA：E.coli tRNA，20 mg/ml 水溶液。

13. 抗体：

一抗：抗 MYC 标签杭体；抗组氨酸抗体（Qiagen 公司）。

二抗：碱性磷酸酶标记的羊抗鼠 IgG。

14. 10X 印迹缓冲液：250 mmol/L Tris 碱，1.9 mol/L 甘氨酸，1% SDS。使用时，100 ml 10X 印迹缓冲液加 700 ml 水，加 200 ml 甲醇配成 1 L 印迹缓冲液。

15. 牛血清白蛋白：组分 V（Amersham 公司）。

16. 考马斯亮蓝染液：0.2%（m/V）考马斯亮蓝 R（Sigma 公司）溶解于 45% 甲醇，9% 乙酸的水溶液中。

17. 干胶装置及玻璃纸：蛋白电泳及电转移装置；蛋白电泳分子质量 marker（Bio-Rad 公司）；硝酸纤维素膜。

18. 丙烯酰胺凝胶配制缓冲液：

2 mol/L Tris-HCl ( pH 8.8 )，1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8），10% SDS。

30% 甲双叉丙烯酰胺-丙烯酰胺溶液：甲双叉丙烯酰胺与丙烯酰胺比例为 0.8：29.2。

10% 过硫酸铵水溶液 ( 新鲜制备），四甲基乙二胺（TEMED），水饱和的正丁醇。