噬菌体抗体库的菌落筛选法

实验概要

本实验介绍了噬菌体抗体库的菌落筛选操作流程。

实验步骤

1. 将每轮筛选洗脱的噬菌体用来感染新鲜的XLIBlu菌，以10μl、20μl等不同量菌液涂于LB氨苄青霉素平皿，37℃ 4~5h。

2. 事先将硝酸纤维素膜在5mmol/L的IPTG溶液中浸泡10min，在超净台中晾干后，铺在上述涂有细菌的平皿中，注意膜面与平皿中培养基界面应无气泡。

3. 置30℃过夜培养，一般约15~16h。

4. 作好标记，轻轻地将硝酸纤维素膜揭开，用氯仿熏蒸固定15min。

5. 将膜置于溶菌酶缓冲液中(50mmol/L Tris pH值8.0，150mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl₂，BSA 3g，溶菌酶40mg，100U DNAase)，每张膜用20~25ml缓冲液，置平皿于小型摇床中，室温阻断1h。

6. 换上述新鲜阻断缓冲液，室温反应1h。

7. 对硝酸纤维素膜进行免疫酶染，方法如常规方法，根据实验需要可选择以下几种策略：

   1) 辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)直接标记抗原蛋白检测；

   2) 用HRP或AP标记的抗人或抗鼠Fab抗体检测；

   3) 加入特异性抗原第一步，加酶标单克隆抗体或抗血清第二步；

   4) 加入特异性抗原第一步，加单克隆抗体或抗血清第二步，加酶标二抗第三步。

根据实验需求而决定，策略2)比较简单，但仅是针对Fab抗体的检测，挑到表达Fab抗体的阳性克隆后需进一步鉴定是否有某种抗原特异性。

8. 对照硝酸纤维膜与相应平皿，挑取单个阳性克隆，置4ml SBA 培养基中，37℃振荡培养过夜，菌液留作菌种，以备后用。