实验概要
本实验介绍了硝酸纤维素膜(NC膜)上的斑点免疫金银染色操作流程。
实验原理
蛋白质抗原通过直接点样或转移电泳吸附在硝酸纤维素膜(NC膜)上，与特异性抗体反应后，在滴加(或浸入)胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的粉红色斑点，称为斑点免疫金染色(dot-IGS)。此反应可再提高银显色液增强，即斑点免疫金银染色法(dot-IGS/IGSS)。
主要试剂
1. 20mol/L，pH7.6 PBS
2. BSA
3. 定影液：20%硫代硫酸钠。
4. 0.05% NaN3
5. 一抗(1-2mg/ml，用含0.1%BSA和正常羊或兔血清的TBS稀释)
6. 金标二抗溶液(金标抗体用含0.4%明胶和0.1%BSA的TBS适当稀释)
7. 0.2mol/L，pH3.5枸橼酸缓冲液
8. 银显色液
9. 定影液
主要设备
1. NC膜
2. 电泳仪和电转仪
3. 微量加样器
实验步骤
1. 用微量加样器在NC膜上直接点样1-2ml(若抗原含量少，可重复点样)，或经转移电泳将抗原吸附在NC膜上，自然干燥；
2. 将点样后的NC膜浸入含5%BSA和0.05% NaN3的20mol/L，pH7.6 PBS内，37℃，30min，以封闭未饱和的蛋白质结合位点；
3. 用含0.1%BSA的TBS洗三次，每次5min；滴加适当稀释的一抗(1-2mg/ml，用含0.1%BSA和正常羊或兔血清的TBS稀释)，阴性对照用稀释液代替抗体，在室温下，反应2h；
4. 用含0.1%BSA的TBS洗三次，每次5min后，将NC膜浸入金标二抗溶液中(金标抗体用含0.4%明胶和0.1%BSA的TBS适当稀释)。反应时间视金标抗体的稀释度而定：一般1：25稀释(OD520 nm值约为0.2)，反应时间为2h；1：100-1：200稀释(OD520 nm值约为0.005)，反应时间为16h；
5. TBS冲洗，即可观察结果。此过程为dot-IGS。
6. 需要是可继续进行银显色反应，行dot-IGSS：将金标抗体染色后的NC膜，用TBS洗三次，每次5min，再用蒸馏水洗涤两次以去除Cl离子，浸入0.2mol/L，pH3.5枸橼酸缓冲液内2min；
7. 移入银显色液中，避光显色5-10min后，再移入定影液中，定影5min；
8. 自来水冲洗，自然干燥。
