基于纸喷雾电离离子淌度质谱在乳腺癌诊断中的应用

　　乳腺癌是全球女性最常见的癌症之一，也是导致女性癌症相关性死亡的主要原因之一，因此早期的发现和诊断对于提高乳腺癌预后和生存率至关重要。目前乳腺癌的筛查方法包括临床乳腺检查、X光、超声和核磁共振成像等。乳房X光和超声常用于筛查无明显症状的乳腺癌，如果检查显示异常，就需要进行穿刺活检进一步确诊。穿刺活检是获取组织样本进行病理检查的常用方法，活检样本通过苏木精-伊红染色(HE）或免疫组化染色(IHC)后由病理医生在显微镜下对样本进行评估。整个过程不仅耗时（通常需要1-2周），还可能出现误判，这都会给患者带来一定的生理和心理负担，甚至延误病情。因此，开发一种可在数分钟内完成乳腺癌快速灵敏的诊断手段非常必要。

　　 质谱通过检测一些分子生物标志物成为疾病早期诊断非常有潜力的工具，如大气压离子化质谱(AIMS)，该技术在大气压下操作，只需很少的样品就可实现原位、实时、快速的标志物检测，并大大减少对患者的侵袭性和诊断时间，在癌症诊断方面具有巨大潜力，包括解吸附电离技术(DESI)、实时直接分析技术(DART)、纸喷雾电离技术(PSI)等。然而，AIMS常受到较强的基质效应干扰，往往需要与其他分析技术联用。离子淌度质谱(IMMS)根据待测物离子迁移率的不同增加了一维分离模式，主要有漂移管IMS (DTIMS)、行进波IMS (TWIMS)和场非对称波IMS (FAIMS)三种类型。目前小型化的FAIMS仪器已经商品化，它可以很容易地与AIMS仪器连接，二者结合可以显著提高代谢物的检测覆盖率和准确性。

　　 最近Huang YC等人建立了一个纸喷雾电离-场非对称波离子淌度质谱（PSI-FAIMS-MS）平台技术检测乳腺穿刺活检标本，该平台可方便地应用于医院的常规临床检查。如图1所示，临床医生使用穿刺针抽吸组织样本后，只需将组织擦拭到层析纸上，然后交由质谱分析人员检测即可。与传统的HE染色法相比，整个采样分析过程可在一小时内完成，诊断用的特征性代谢物可被高灵敏地检测，具有令人满意的预测准确性，并且可实现样本的高通量检测。

图1 乳腺穿刺活检采集及PSI-FAIMS-MS代谢物轮廓表征示意图

　　 研究者收集了202例乳腺穿刺活检样本及其标准病理诊断报告，并使用建立的PSI-FAIMS-MS平台技术进行分析。首先，研究者在正离子检测模式下通过优化不同的FAIMS条件，包括分散场强度（DF）和补偿场强度（CF），增强极性小分子代谢物的信号强度（试验I：43例乳腺穿刺活检样本，29例为良性，14例为恶性）和脂质代谢物的信号强度（试验II：159例乳腺穿刺活检样本，117例为良性，42例为恶性）。为验证FAIMS的作用，每个样本的质谱数据均在FAIMS-off和FAIMS-on两个条件下采集，每个样品的采集时间小于5分钟，获得10−20个谱图。典型的良性和恶性乳腺组织的PSI-FAIMS-MS图如图2所示，可见两种组织的MS图呈现出较大差异。

　　 通过比较良性和恶性乳腺组织的MS图，发现乳腺癌诊断潜在的生物标志物。然而，在组织样本中获得的质谱数据非常庞大，因此，研究者对数据的挖掘采用了机器学习的方法。该方法从给定的训练数据集中估算未知的依赖关系，并利用这些依赖关系来预测新的数据集。研究者通过不同的机器学习模型进行评估，发现LASSO模型（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator）效果最好。基于此，研究者使用商业化软件构建了LASSO模型，用于数据的分类和预测。将患者随机分为训练组和测试组，比例为7:3。LASSO模型根据每个样本采集到的质谱数据建立训练数据集，根据标准病理报告提供的组织类型(良性或恶性)进行分类，然后以每个特征信号(谱图中的m/z数值和丰度)计算数学权重表征乳腺组织的类型，最后利用独立测试数据集进行LASSO模型验证，评价分类模型的性能。

图2 代表性PSI-FAIMS-MS谱（正离子检测模式）

(a)良性乳腺组织和(b)恶性乳腺组织

　　 在试验I中，训练集和测试集分别包括30和13个样本。通过优化FAIMS (DF = 220 Td, CF =  -0.1 Td)条件，增强了极性小分子代谢物和脂质代谢物的信号强度。与在FAIMS-off条件下获得数据通过训练得到的模型相比，在FAIMS-on条件下，预测精度从61.5%显著提高到84.6%。这可能是由于过滤了许多无关信号，如溶剂峰或随机噪声，如图3所示，与潜在生物标志物相关的离子信号得到了显著增强。

　　 LASSO模型将离散离子的m/z值作为乳腺癌特异性模式识别的特征，特征离子权重的绝对值越大，它们在预测组织类型中的作用越显著。正的权重值表明该特征离子在恶性组织中相对丰度高于良性组织，被认为是癌组织的潜在生物标志物。例如，离子m/z 309.2权重值最大，成为最重要的预测特征离子，通过高分辨质谱和串联质谱分析，鉴定该离子为N1,N12 -二乙酰精胺的单电荷加钠离子。此外，m/z 287.2信号被鉴定为N1,N12 -二乙酰精胺的分子离子，也是一个重要的特征离子。已经有文献报道尿液中N1,N12 -二乙酰精胺作为乳腺癌的诊断和预后标志物。

图3 不同条件下良性乳腺组织的PSI-MS谱（正离子检测模式）

(a)FAIMS-off，(b) FAIMS-on：DF = 220 Td, CF = −0.1Td，(c) FAIMS-on：DF = 220 Td, CF = 1.0Td（脂质信号增强）

　　 在试验II中，研究者扩大了穿刺活检样本集用以进一步验证LASSO模型的预测性能，训练集包含111个样本，测试集包含48个样本。通过优化FAIMS条件(DF = 220 Td, CF = 1.0 Td)，进一步增强了脂质代谢物信号强度。如图3所示，在该条件下脂质信号得到最大程度增强，预测精度从79.2%提高到84.6%。另外，随着样本量的增加和FAIMS条件的优化，LASSO模型预测的总体准确率达到了87.5%，敏感性从61.5%提高到76.9%，特异性从85.7%提高到91.4%，表明当FAIMS-on时，获得了更好的相关化合物的信号，提高了模型预测的准确性、敏感性和特异性。图4是在FAIMS-on（DF = 220 Td, CF = 1.0 Td）条件下基于LASSO模型的权重图揭示出的特征性代谢物轮廓，可见FAIMS作为一种离子选择和过滤器提高了标志物的表征能力，并且通过多种生物标志物组合谱代替单一的生物标志物可以更有效地提升对乳腺癌的诊断性能。

　　 此外，研究者还使用LC-HRMS/MS鉴定了乳腺组织中的特征脂质代谢物。例如，恶性乳腺组织中发现的相对丰度较高的特征离子m/z 806.5和m/z 741.5，初步鉴定为PE(20:4/18:0)和PG(14:1/18:1)；恶性乳腺组织中相对丰度较低的特征离子m/z 758.6和m/z 756.5被鉴定为PC(16:0/18:2)和PC(32:0)。许多鉴定到的代谢物是已被报道的乳腺癌相关的特征代谢物。

图4 在FAIMS-on（DF = 220 Td, CF = 1.0Td）条件下基于LASSO模型的权重图揭示出特征性代谢物

　　 综上，研究者开发了一种用于穿刺活检的代谢物轮廓分析的PSI-FAIMS-MS平台技术，结合机器学习用于乳腺癌诊断。研究结果表明，该方法获得的代谢产物谱可用来区分乳腺活检样本的良性/恶性。与常规病理学诊断相比，该方法操作简单，借助于分类模型，仅需数分钟即可获得预测结果，且准确性达到87.5%。未来，通过获得更多临床样本的数据集，可能会实现一种诊断更准确成本更低廉的解决方案，成为临床上快速、廉价、智能的乳腺癌诊断手段。

　　参考文献

　　Huang YC, Chung HH, Dutkiewicz EP, Chen CL, Hsieh HY, Chen BR, Wang MY, Hsu CC. Predicting Breast Cancer by Paper Spray Ion Mobility Spectrometry Mass Spectrometry and Machine Learning. Anal Chem. 2020, 92(2): 1653-1657.