基因功能研究策略

随着人类基因组计划的顺利进行,越来越多的新基因被发现,基因功能研究成为生命科学领域中的重大课题,目前基因功能研究方法主要有基因转导、反义技术、转基因和基因剔除、染色体转导、RNA 干涉等。

一、 正常情况：

DNA→mRNA→蛋白质→功能（遗传效应以及表型）

二、 基因功能研究策略：

1、 基因功能的获得（gain-of-function）如：GFP转基因鼠

Ⅰ、基因转移（transgenic）：

①、 指外源基因导入受体细胞后能随即整合到受体的染色体中，而相对稳定地表达,通过观察细胞生物学行为的变化来认识基因的功能,是目前应用最多、技术最成熟的基因功能研究方法。

②、若受体细胞不具备该外源基因，则其获得新的功能；若受体细胞具有该基因，则该基因在受体细胞内得到过渡的表达，即基因诱导超表达技术。

③、包括：

a、DNA介导的基因转移:由于基因表达受转导效率和是否持续稳定表达两方面因素影响,因此需慎重选择转导系统。常用的基因转导系统分为非病毒性表达系统和病毒性表达系统。

b、染色体介导的基因转移（只用于少数情况）: 将大的DNA 片段克隆入酵母人工染色体、细菌人工染色体中可产生较好的表达水平和组织特异性,并可精确地调节同源重组。

Ⅱ、基因敲入（gene knock-in）: 基因打靶的一种方式，即通过基因打靶用一种基因替换另一种基因,以便确定它们是否具有相同功能。插入性载体：将正向选择基因插入内源基因的功能区域造成插入突变。

2 、基因功能的缺失（lose-of-function）：如：KIT基因的突变

Ⅰ、基因敲除（gene knock-out）:基因打靶的另一种方式

①、基因敲除：

a、造成内源基因的敲除是利用DNA 同源重组(用含有已知序列的DNA 片段与受体细胞基因组序列相同或相近的基因发生同源重组) 原理进行的基因打靶最早也是最普遍的一种修饰内源基因的方式,通过敲除内源基因的功能片段,造成内源基因的结构或组成的突变,基因功能丧失,表现出特定的表型效应,可以反映该基因的功能。

b、置换型载体：造成内源基因一个功能片段被正向选择基因置换,带来缺失突变是进行基因敲除的常用方法。

c、利用基因敲除研究基因的功能已经成为基因组计划中的非常重要的一个方面。

②、基因打靶（gene targeting）：外源的DNA片断与同源的内源性序列定向重组（同源重组），导致遗传信息的定向修饰。包括：1.基因灭活；2.点突变引入；3.缺失突变；4.外源基因定位引入；5.染色体重大片断删除。

Ⅱ、基因转录后沉默－RNAi（knock-down）:敲低表达效率

①、反义技术： 根据碱基互补原理,利用人工或生物合成的特异互补的DNA 或RNA 片段(或其修饰产物) 抑制或封闭目的基因的表达。包括反义寡核苷酸技术、反义RNA 技术和核技术

②、RNAi 是一种普遍的转录后基因沉默的机制,它是由一类外源性的RNA 分子—siRNA所引起的具有很强的关闭基因的功能,它能够介导RNA干涉现象,

③、RNAi 技术就是通过人为地引入与靶基因具有同源序列的dsRNA ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。

3、 “dominant negative”策略：“dominant negative”策略是指利用基因工程技术获得特定基因的“dominant negative”突变体,使其高表达,由于高表达的突变体的“dominant negative”作用而产生负面和不正常的效应,通过分析产生的负面或不正常的效应来推断该基因的功能。

4、 转基因动物：利用基因剔除(Gene knockout) 技术或转基因技术获得的模式生物可能是目前研究基因功能最具价值的手段。

5、 基因诱导超表达技术