基因枪轰击洋葱表皮观察GFP瞬时表达

实验概要

本实验在构建了OsAGAP瞬时表达载体的基础上，采用基因枪轰击洋葱表皮观察了GFP的瞬时表达。

主要试剂

高渗培养液(MS无机盐、40g/L甘露醇)，高渗固体培养基(MS无机盐、40g/L甘露醇、0.7% agar)，无水乙醇，无菌去离子水，12.5 M CaCl₂，0.1 M亚精胺，等渗培养基(MS培养基)

主要设备

高速离心机，1.5 ml Ep管，涡旋器，超净台，基因枪，气瓶，激光共聚焦显微镜

实验材料

洋葱内表皮

实验步骤

1. OsAGAP瞬时表达载体构建

以5'-CTTCTAGACCA GCC AGG AGA AAT CCA-3’为5’引物(下划线为引入的XbaI位点)，5'-AAGGTACCAAA TTT CTG AAC GCA GC-3’作为3’引物(下划线为引入的KpnI位点)进行PCR扩增，将扩增到的片断克隆到pGFP221上，构成pGFP221-OsAGAP瞬时表达载体。

2. 基因枪轰击洋葱表皮观察GFP瞬时表达

   1) 实验材料准备

撕取洋葱内表皮，置于高渗培养液(MS无机盐、40g/L甘露醇)中，室温100 rpm处理4 hours；然后转入高渗固体培养基(MS无机盐、40g/L甘露醇、0.7% agar)。

   2) 金粉准备

      a. 称取60 mg金粉放入1.5 ml Ep管(最好为烷硅化的进口管，减少金粉沾壁)；

      b. 加入1 ml的无水乙醇，涡旋振荡1-2 min；

      c. 冰上静置5 min后，10，000 rpm离心1 min，去上清；

      d. 重复a，b步骤重新清洗金粉三次；

      e. 室温，10，000 rpm离心1 min，去上清；

      f. 加入1 ml无菌去离子水，涡旋振荡1-2 min，冰上静置5 min；

      g. 室温，10，000 rpm.离心1 min，去上清；

      h. 重复g步聚两次；

      i. 加入1 ml无菌去离子水，按50ul每份分装到己灭菌的1.5-ml Ep管中备用(分装时应在无菌条件下边涡旋振荡，以保证分装均匀)

(注：以10枪/3 mg计算，具体实验可按比例进行换算，无水乙醇清洗处理好的金粉可继续用无水乙醇中-20℃长时间保存，实验中金粉沾壁时，最好用超声波处理，不进行无菌培养的材料可以不需要严格的无菌操作)

   3) DNA包裹金粉微粒(具体实验可按比例进行以下操作)

      a. 取50ul金粉悬浮液(已分装好)，在连续涡旋振荡下按顺序加入

      5ul质粒DNA (1ug/ul)

      50 X12.5 M CaCl₂

      20 ul0.1 M亚精胺

      b. 涡旋振荡3 min；

      c. 室温下离心10，000 rpm 10 sec，尽可能去净上清；

      d. 加入250ul无水乙醇，涡旋振荡1-2 min；

      e. 室温下离心10，000 rpm 10 sec，尽可能去净上清；

      f. 加入60ul无水乙醇(可进行4-8次轰击)。

   4) 基因枪轰击操作(无菌条件下进行)

      a. 超净台紫外灯灭菌20min；

      b. 载体膜、可裂膜、阻拦网等事先置于70%乙醇中1 min，灭菌滤纸上自然风干；将气瓶调节压力到1300psi；

      c. 取8-9ul已用DNA包裹好的微粒悬浮液加到微粒载体膜中央，稍微晾干后马上进行轰击；

      d. 将可裂膜、阻拦网、涂有微粒载体膜安装进固体装置中，射击参数为：轰击微粒运行距离为12cm，压力1110psi，真空度25mmHg；

      e. 轰击结束后的材料，转移到等渗培养基(MS培养基)中培养一天一夜；

      f. 使用激光共聚焦显微镜488nm波长激发下，观察GFP的表达。