基因检测：NGS在病原微生物检测中的应用

文章导读

　　感染性疾病是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病。目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原体呈现多样化和复杂化的发展趋势。近年来快速发展的NGS技术因其不依赖于已知核酸序列，无需特殊探针设计，可直接对未知病原微生物进行检测，打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物领域展现了广阔的前景。

感染性疾病简介

　　感染性疾病多为细菌、病毒和真菌等病原体及其产物所引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍，具有较大的危害性和较高的病死率。目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原体呈现多样化和复杂化的发展趋势。

　　重症急性呼吸综合征、新型冠状病毒感染、新变异型克雅病、H7N9 禽流感等新发感染性疾病不断出现。而HIV、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、沙眼支原体等经典感染性疾病病原体又死灰复燃或出现新的致病特征。各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明病因的发热等，都给人类健康带来了巨大的威胁，因此，临床上对感染性疾病诊断的准确性和时效性提出了更高的要求。

感染性疾病诊断现状

　　快速、准确的诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。随着分子检测技术的不断发展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床应用日益广泛，已成为一些重要的感染性疾病的诊断和疗效评价中不可缺少的重要工具。目前常用的病原微生物分子检测方法主要包括：基于PCR的电泳法、实时荧光定量PCR（QPCR）、数字PCR、基因芯片技术、测序技术（Sanger测序技术、焦磷酸测序技术、高通量测序技术）等。

　　在感染性疾病领域中，获得病原体的活体（对于细菌、真菌、病毒而言，主要是培养阳性），是感染性疾病诊断的金标准，但病原体的体外培养耗时普遍较长，操作步骤繁琐，且绝大多数病原体不可培养；免疫学方法（如补体结合试验、中和试验、酶联免疫吸附实验、免疫荧光法和酶标斑点免疫法等）操作简单，但由于病原体种类繁多，已研发的抗原、抗体数量远远不能满足市场需求；PCR 检测具有极高的灵敏度和特异性，但无法完成高通量筛查，检出率较低；基因芯片技术只能对已知的病原体基因组进行意向性筛查， 而无法检测新的未知病原体。据统计，约70%的感染性疾病患者因传统检测方法无法确定病原体信息，不能得到及时有效地救治，从而使病情恶化。因此，快速、特异且高通量的病原体检测方法，对有效诊断和及时防治感染性疾病具有重要的意义。

　　近年来快速发展的NGS技术因其不依赖于已知核酸序列，无需特殊探针设计，可直接对未知病原微生物进行检测，打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物领域展现了广阔的前景。

NGS 在临床微生物检测中的应用

　　1. 感染性疾病的病原体鉴定

　　传统的病原微生物鉴定方法主要有涂片镜检、分离培养、生化反应和质谱等方法，但其存在周期长、过程复杂及灵敏度低等缺点，如分枝杆菌菌种鉴定需要长达30～40 d的时间，而一些苛养菌及病毒对培养条件要求极其苛刻，甚至不能培养。以PCR 为基础的分子诊断技术解决了上述部分病原体鉴定的问题，但难以解决未知微生物的检测难题未知微生物在未知核酸序列时无法设计引物，成为这类技术的最大障碍。NGS检测则无需对病原体进行分离培养，也不依赖已知核酸序列，可直接对标本进行测序鉴别，大大节省了检测时间，提高了诊断效率，在对未知物种及难以培养的病原体鉴定方面具有无可比拟的优势。

　　NGS 在病原体鉴定方面的应用主要有2种形式 ， 即rRNA基因测序和全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）。rRNA 基因测序在临床上常用于细菌、真菌的鉴定，同时也是菌群分析的基础。WGS与rRNA基因测序相比，可获取的信息更加全面，适用于病毒鉴定。因大部分病毒不可培养，且高度变异，NGS 与 Sanger测序、基因芯片等法相比，效率更高，且无需设计特定探针，更适合用于复杂临床标本中的病毒鉴定。

　　2. 病原体分型及流行溯源

　　病原体分型方法包括基因组重复序列扩增、随 机扩增多态性 DNA、脉冲场凝胶电泳、多位点序列分型技术等。这些技术可检测病原体的型别，但分辨率较低，对于相似或变异度极高的病原体如病 毒等则常无法区别，而 NGS则弥补了此项缺陷，其可检测病原体全基因组序列，获得全部遗传信息，被认为是分辨率最高的病原体分型方法。近年来，随着抗生素的不规范使用甚至滥用，使细菌耐药情况日益突出，耐药菌株在医院内的暴发流行时有发生。因此，对流行细菌进行追踪和溯源十分重要。在对耐药菌等病原体进行分型的基础上，判断同源性远近，分辨出不同的进化路线，可追踪或预防流行性疾病的大暴发。

　　3. 病原体耐药及毒力特征检测

　　在抗生素和宿主免疫等多重因素的压力下，病原体在毒力和耐药方面均发生了相应改变。各种高毒力株及耐药株的出现是导致感染性疾病发病率和病死率居高不下的重要原因。临床上病原体耐药及毒力特征的检测常规采用体外药物敏感性试验、耐药菌表型检测或核酸扩增等方法。这些方法操作繁琐，且较费时、费力。NGS 通量高、快速，在一次测序反应中即可获得细菌整个基因组的耐药、毒力等相关基因信息，同时还可对目的基因、基因定位、基因环境、质粒相关序列等开展全面研究，有助于揭示病原体毒力及耐药机制，对临床治疗及指导用药均具有重要意义。

　　4. 与人体疾病相关的微生态失衡宏基因组

　　宏基因组学（Metagenomics）以微生物生态群落中所有微生物的基因组为研究对象，通过研究群落中物种组成和功能组成、同一个群体内不同微生物的相互作用、微生物群落与宿主之间的相互作用，并进行不同表型的样品比较、分析，来解释生物学 现象。近年来，NGS 技术越来越广泛地被应用于肠道微生物领域的宏基因组学研究。多项研究表明，肠道菌群与宿主共生并共进化的过程中，在营养、代谢及免疫等多个方面影响着人体健康。肠道微生态失衡与人体多种疾病，如感染性疾病、肥胖症、糖尿病、肝病、冠心病及肿瘤等之间存在密切关系。

　　肠道微生物宏基因组学研究则为研究肠道微生物与相关疾病的关系开辟了新途径，是近年来研究的热点。肠道微生物中关键功能菌更是有可能成为疾病诊治的新型生物标志物和治疗靶点。此外，病毒宏基因组测序直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，可快速鉴定所有病毒组成，在对已知或未知病毒病原体的及时发现和动态监测等方面具有突出优势，对病毒感染性疾病的防治有 重要意义。NGS因其测得数据量大、成本低、速度快的特点，无疑将成为研究肠道微生物和宏基因组学的有力工具。

NGS 在应用中面临的挑战

　　目前，NGS 技术常规应用于临床病原学检测仍存在很多实际问题:

　　病原体鉴定的准确度很大程度取决于分析的参考数据库的范围和完整性；

　　临床标本的复杂性，可能使病原体信息太少而导致数据丢失或病原体数据混杂在正常菌群中难以区分；

　　NGS测序数据的解读至关重要，测序的长度、数量、质以及试剂可能的细菌污染，均可影响病原体识别，导致标本中细菌多样性估计过高；

　　目前尚未建立不同标本测序前处理和参数设置的统一规定，微生物 NGS测序质量评估、质量控制体系亦尚在建立中。

　　中国基因检测行业市场快速发展，增长速度远超全球水平，未来市场空间巨大，预计2020年将增长至378.8亿元人民币。我国作为人口大国，基因检测行业已成为国家“精准医学”战略规划的重要组成部分，发展前景广阔，而病原微生物基因检测的市场有更加广阔的空间值得我们去开拓。