基因组DNA提取与PCR扩增技术

一、基因组DNA提取

实验目的

基因组DNA的制备是基因分析的前提。 本实验要求掌握基因组DNA提取的基本方法。实验原理 DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的。核酸与蛋白质之间的结合力包括离子键、氢键、范德华力等，破坏或降低这些结合力就可把核酸与蛋白分开。 DNA、RNA所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在260nm处，所以，可用紫外分光光度法测定DNA的浓度。

基因组DNA提取试剂盒：

在高盐的状态下，DNA纯化树脂专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。

器材与试剂

台式高速离心机、天平、水浴恒温箱、移液枪、塑料离心管等 试剂盒（纯化树脂、GN结合液、漂洗液、无水乙醇、离心纯化柱）、TE缓冲液操作

1、将全血轻轻混匀，转移0.5ml全血到1ml纯化树脂中，颠倒混匀5-6次，室温，3min。其间要颠倒混匀1次，5000r/min离心×3sec；

2、取沉淀，加1mlGN结合液悬浮沉淀，颠倒混匀，5000r/min离心×3sec；

3、取沉淀，加0.5ml漂洗液纯化树脂2次，颠倒混匀，5000r/min离心×3ecs；

4、取沉淀，加0.8ml无水乙醇悬浮沉淀，颠倒混匀；装入离心纯化柱，12000r/min离心×1min，弃乙醇液；

5、空柱再12000r/min离心×1min，进一步弃乙醇液；

6、取离心好的纯化柱套入一干净的1.5ml离心管中，加入100ulTE缓冲液于纯化树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置3min，12000r/min离心×2min。注意事项 一般情况下，纯净的DNAOD260/OD280比值约为1.8，RNA为2.0。若样品中含蛋白质，则比值下降，必要时需重新抽提。若DNA的比值<1.75，则加入SDS至0.5%； 从核酸中去除蛋白质时，常用到酚：氯仿等体积混合液。氯仿的作用是使蛋白质变性并有助于水相和有机相的分离； DNA用TE溶解，可增加DNA的稳定性，便于长期保存。

二、PCR扩增技术

实验目的

本实验以所提出的全血基因组DNA为模板，以线粒体基因上一段核苷酸为引物，扩增出924bp的扩增产物。学习并掌握PCR反应的基本原理与实验技术。实验原理 多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。

可简述为： 在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA，四种脱氧核苷酸（dNTP），和耐热Taq聚合酶及两个合成的DNA引物，并有Mg2+存在。 加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。 降低溶液温度，使合成引物在低温（56℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。 溶液反应温度升至中温（72℃），在Taq酶作用下，以四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。

如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。经过25～35个循环，DNA扩增倍数可达106～109。

器材和试剂

器材 PCR扩增仪，旋涡振荡器，台式离心机，加样枪及枪头等试剂

1、蓝色管：TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg＋＋等

2、黄色管：引物1（68kb上游）、引物2（69kb下游）

3、白色管：无菌ddH2O

4、模板DNA：为本次实验所提出的全血基因组DNA操作 无菌ddH2O21.5ulTaq酶等25ul引物1（68）0.6ul引物2（69）0.9ul模板DNA2ul 混匀后，离心5000r/min×1min，置PCR仪PCR扩增的设定： 设置PCR扩增仪的热盖温度为100℃预变性：94℃5min循环：94℃变性30s 56℃退火30s30个循环72℃延伸30s 末次延伸：72℃5min4℃保存

注意事项

1.由于PCR技术非常敏感，可使一个DNA分子得以扩增，装有PCR试剂的微量离心管打开之 前，应先在微量离心机上作瞬时离心使液体沉积于管底。

2.zui好在加完所有其它反应成分后才加模板DNA，加模板DNA时不要形成喷雾。

3.若用没有热盖的PCR扩增仪，则需在反应体系中加入液体石蜡等矿物油封闭体系以防止反应 过程中液体的蒸发。