基因组DNA的纯化与回收

实验概要

质粒、噬菌体等经酶切，电泳；PCR产物经电泳后，常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记、测序等。DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。

主要试剂

酚、氯仿、NaAc、无水乙醇、TE、Tris-HCl饱和酚、异丙醇、低融点琼脂糖、DNA回收试剂盒等.

实验步骤

冻融法：

 1.  紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于0.6g）捣碎，置于1.5ml离心管中;
 2.  加入等体积的Tris-HCl饱和酚（pH 7.6），振荡混匀；

 3.  -20℃放置5-10min；

 4.  4℃离心10000g×5min，上层液转移置另一离心管中；

 5.  加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；

 6.  -20℃，放置5-10min；

 7.  4℃离心10000g×5min，合并上清液；

 8.  用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；

 9.  加入1/10体积3M NaAc（pH 5.2）、2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀；

 10. -20℃，静置30min；

 11. 4℃离心13000g×10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；

 12. 加适量H2O或TE溶解沉淀。

 DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）：

 1.  紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。

 2.  加入Buffer QG（每100mg凝胶加Buffer QG 300μl），置50℃水浴10min。

 3.  若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇（每100mg凝胶加异丙醇100μl），混匀。

 4.  将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上

 5.  4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体

 6.  加入500μl Buffer QG于柱上，4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。

 7.  加入750μl Buffer PE于柱上，4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。

 8.  4℃离心13000g×1min。弃去收集管。

 9.  将柱放于一新1.5ml离心管上，加50μl EB于柱上。放置1min，4℃离心13000g×1min。

 10. 取5μl 回收DNA电泳检测。

注意事项

1. 紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。
2. DNA在凝胶电泳中不能加EB，应当加相应的指示剂，切电泳条带尽量要细，不要把多余的琼脂切进去。
3. 取酚和氯仿时要带一次性手套，因为酚和氯仿具有腐蚀性。