基因编辑那么热，可是你都会用了吗？

　　基因编辑是一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，通过改变生物的遗传基因，使其特定的基因功能丧失作用，通过研究对生物体造成的影响，进而推测出该基因的生物学功能。本文为你科普基因编辑三大技术：

　　基因敲除

　　进行DNA水平编辑。一般用于构建基因敲除鼠模型。

　　CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系统，通过RNA介导特异性的切割外源遗传物质，用以对抗入侵的病毒和质粒。使用Cas9切口酶和一对sgRNA，两个相近的切口造成DNA双链断裂，诱导细胞发生非同源末端连接修复，造成目的基因的突变。

　　CRISPR/Cas9技术自问世以来，取代“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN），成为科研、医疗等领域的有效工具”.一般通过体外转录得到sgRNA与cas9的mRNA，通过注射到原核期受精卵内，移植到假孕母鼠体内获得基因编辑的小鼠进行基因功能研究。

　　构建方法：

　　确定待敲除基因的靶位点。

　　设计识别靶位点的识别的一对sgRNA。

　　构建可表达sgRNA的Cas9质粒。

　　体外转录sgRNA 和Cas9 RNA。

　　将sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵检测sgRNA活性。

　　将有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder。

　　将Founder自交得到F1代。

　　适用范围：

　　制备敲除鼠，利用敲除鼠进行基因功能的研究；进行细胞水平敲除基因时，可以选择慢病毒载体，构建lenticrispr-v2质粒，通过包装病毒进行细胞水平敲除。

　　基因敲减

　　RNA水平，是指通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。一般用于细胞水平敲减基因。

　　（1）RNA干扰：

　　是siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物RISC。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默。

　　一般合成针对靶基因的siRNA，通过转染的方法使之进入细胞内，使靶基因沉默。这一方法受转染效率的影响较大。目前有不少基因的siRNA已经有商业产品，所以使用时买来就可以了，比较方便。

　　适用范围：

　　一般通过公司合成后，通过转染细胞进行细胞水平敲减。

　　（2）shRNA：

　　“短发夹RNA”，shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。

　　构建shRNA的病毒表达载体，常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等，机制与质粒载体相似，利用了病毒感染细胞效率比较高的特点，解决了用质粒载体转染效率低的缺陷。

　　构建方法：

　　shRNA设计：设计RNA干扰序列是RNAi实验的关键。

　　载体构建：可根据实验需求选择慢病毒、腺病毒载体。

　　转染细胞：常用的方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔转染等

　　观测GFP 荧光和稳定表达细胞系筛选：可用于带有GFP标签的质粒载体。

　　检测RNA 干扰效率：可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。

　　适用范围：

　　一般通过构建慢病毒、腺病毒等进行细胞水平敲减。