外源基因在大肠杆菌中诱导表达与检测

原理

目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。在培养体系中加入IPTG 诱导T7 RNA 聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA 开始转录。

本实验采用已经构建好的表达载体pET，该载体带有来源于古细菌的单链结合蛋白质（SSB）的序列，经IPTG的诱导，实现外源基因的表达，并通过SDS-PAGE对表达产物进行检测。

一、主要仪器、材料、和试剂

1. 仪器

恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，垂直板蛋白质电泳装置，生化培养箱，电泳仪，超净工作台，移液器。

2. 材料

含有表达载体pET-28的BL21菌株。

3. 试剂

IPTG 储液(200mg/ml)：在800μl 蒸馏水中溶解200mg IPTG 后，用蒸馏水定容至1ml，用0.22μm 滤膜过滤除菌，分装于离心管并储于-20℃。

二、操作步骤

1．重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

将已经验证的带有SSB－pET28重组质粒的大肠杆菌BL21在含有卡那霉素LB的平板上划线培养。挑取长出的单菌落接入液体LB试管中，加入卡那霉素至终浓度为50ug/mL，37℃摇床过夜。按1％接种量接入100mL LB培养基，加入卡那霉素至终浓度为50ug/mL，37℃摇床培养至菌浓OD600达到0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mM，37℃摇床继续培养4h，诱导SSB蛋白表达。每隔两个小时取样进行实验。

2. 蛋白质SDS—PAGE

在蛋白溶液中加入样品缓冲液，100 oC处理5min，离心取上清5－15mL点样。于75V～100V电泳约2h，凝胶在考马斯亮兰G250染液中染色1h，在脱色液中脱色。