RAYPA自动培养基制备器在大肠菌群测定中的应用

　　方案摘要：大肠菌群是一群能发酵乳糖并产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。本方法使用RAYPA自动培养基制备器，主要围绕培养基的精准制备与微生物检测的标准化需求展开。通过自动化技术确保培养基的成分、灭菌条件和使用流程符合检测标准，从而提升大肠菌群检测的准确性、效率和重复性。

　　方案详情：

　　一、实验原理

　　多管发酵法是水中总大肠菌群检测的常用方法，其核心原理依托于总大肠菌群的生物学特性，即能够发酵乳糖并产酸产气，同时具备革兰氏染色阴性、无芽孢且呈杆状的特点。该检测过程通过三个步骤依次开展，最终实现对水样中总大肠菌群数量的测定。多管发酵法需要分装大量的乳糖胆盐发酵培养液，fluidot自动液体分装仪可以一次性装四个试管架，循环做业。大大减轻实验人员的工作压力，提高实验效率。

　　二、‌实验准备

　　1、设配和材料

　　除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下:

　　① 试管。

　　② 小倒管。

　　③ 电动移液器：pipetty MSIC90-001-10mL。

　　④ 手动移液器：fluidot MSP1K-1ML。

　　⑤ 恒温培养箱：36 ℃±1℃。

　　⑥ 冰箱：2 ℃~8 ℃。

　　⑦ pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。

　　⑧ RAYPA自动培养基制备器。

　　⑨ Fluidot自动液体分装仪。

　　2、培养基和试剂

　　① 乳糖胆盐发酵培养液。

　　② 亮绿乳糖胆盐培养液。

　　③ 无菌生理盐水。

　　④ 无菌磷酸盐缓冲液。

　　三、检验程序

　　1、大肠菌群多管发酵法的检验程序如下：

　　四、实验步骤

　　1、使用RAYPA自动培养基制备器，自动制备实验所需的培养液、无菌水及缓冲液，并按实验要求分装到合适的容器内。

　　2、初发酵实验

　　① 使用Pipetty电动移液器吸取 10 mL 水样接种到 10 mL 双料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5份。

　　② 吸取1 mL 水样接种到 10 mL单料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5份。

　　③ 吸取1 mL 水样接种到9mL无菌生理盐水或无菌磷酸盐缓冲液中，混匀，从中吸取1 mL稀释液到 10 mL单料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5份。

　　④ 轻摇试管（避免小倒管中产生气泡），使液体充分混合，置 36 ℃±1 ℃培养箱内培养 24 h±2 h。观察每管是否产气，如有气体产生则为初发酵试验阳性，如不产气则为大肠菌群阴性。

　　3、确证实验

　　① 初发酵试验阳性管中培养液充分摇匀后，取一接种环培养液，接种到10 mL亮绿乳糖胆盐培养液中，置 36 ℃±1 ℃培养箱中培养 48 h±2 h。

　　② 观察亮绿乳糖胆盐培养液中小倒管内的产气情况，如有气体产生，就可确定为大肠菌群阳性，记下产气的阳性试管数，查表28可得出水样中大肠菌群的MPN值；如无气体产生则为大肠菌群阴性。

　　4、MPN值的计算

　　如水样含菌量少，可按 100 mL、10 mL、1 mL 接种，实际 MPN 值应为表中的 MPN 值除以 10；如水样含菌量多，可按1 mL、0.1 mL、0.01 mL接种，实际 MPN 值应为表中的 MPN 值乘以10，以此类推。

　　5、列举说明

　　假设初发酵试验 15 支试管中的阳性管数如下：

　　在接种量为 10 mL 的管中有 5 支管阳性；

　　在接种量为1 mL 的管中有 4 支管阳性；

　　在接种量为 0.1 mL的管中有2支管阳性；

　　作为初发酵试验结果为 5-4-2。当把以上阳性管转种到亮绿乳糖胆盐培养液管里，经培养后，若确证试验所给的结果为 5-3-1，那么査表 28，可得出每 100 mL，水样中大肠菌群的 MPN 值为 110。接种量为1 mL，0.1 mL，0.01 mL时，MPN值为1100。

　　五、 结果与报告

　　根据确证试验证实的乳糖胆盐发酵管反应阳性管数，检索方法对应的MPN表，报告每100 mL 样品中大肠菌群的MPN值，以 MPN/100 mL表示。当所有接种水样的乳糖胆盐发酵管均为阴性反应，可报告100 mL水样中未检出大肠菌群。