多参数基因分析在个性化肿瘤疫苗研发中的运用价值

　　癌细胞在快速生长和增殖过程中，往往来不及修复DNA在复制过程中出现的错误，因此会出现许多新的突变蛋白，称之为肿瘤新抗原。早期研究认为绝大多数肿瘤新抗原所携带的突变本身对肿瘤细胞的生长并没有影响，属于被忽略的副产物。随着研究深入，近期科学家发现即使同种癌症患者身上的突变都不尽相同，新抗原也有所差别，可作为特异的标记物被免疫细胞识别。而个性化肿瘤疫苗的原理正是在于：通过寻找每个患者特有的突变，做到对症下药。例如A、B两名患者都携带有p53的基因突变，但A患者同时携带x+y突变，而B患者则携带m+n突变；那么激活对抗“x+y”的免疫细胞，对携带“m+n”突变的癌细胞是无效的。因此，肿瘤疫苗通过发现患者体内特异性表达的肿瘤新抗原，继而个性化激活免疫系统，实现真正的个体化精准治疗。

　　研究成果为肿瘤治疗带来新希望

　　来自美国波士顿Dana－Farber癌症中心和德国美因茨大学的两个研究团队分别在《Nature》上发表了题为"An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma"和"Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer"的文章，展示了针对肿瘤的“个性化疫苗”在临床上取得的重大突破。

　　两个项目都是首先对患者肿瘤组织样本进行取样测序，并分别使用自己独特的算法预测哪些突变最有可能引起免疫反应。然后分别开发出了以多肽片段和RNA为基础的疫苗，并在晚期黑色素瘤3期或4期的中晚期复发高危人群身上展开了研究。

　　在来自Dana Farbar研究所的Wu博士带领的团队中，研究人员为每位患者量身定制了包括13－20种不同的含有新抗原的多肽疫苗（图1，ref 1）。常规临床数据显示该类晚期肿瘤的复发率高达50%，而结果显示6位患者中，4位患者在接受疫苗两年后没有出现复发迹象。另外2名患者出现了复发迹象，但是在接受了PD－1抗体药物治疗后获得了完全缓解。

图1: Generation of a personal, multi-peptide neoantigen vaccine for patients with high-risk melanoma.

　　类似结果在另一组研究中也被发现。由Ugur Sahin教授率领的美因茨大学团队为每位患者研发了含有不超过10种不同的编码新抗原的RNA片段（图2，ref 2）。13位受试者中，8位在接受疫苗后一年内没有出现复发迹象，其他5名患者在接受疫苗时肿瘤已经出现扩散，其中2名在接受疫苗后肿瘤缩小，另外1名患者在接受PD－1抗体药物后得到完全缓解。

图2: Vaccine design, manufacturing and clinical study procedure.

　　机遇与挑战共存

　　虽然上述两项研究在临床上都取得了突破性的进展，有望为肿瘤治疗开启新的研究方向，但是目前该方法还面临着一些挑战，最主要的问题是生产疫苗的时间。Wu博士表示如何缩短疫苗生产时间是进一步研究的主要方向之一。

　　其中一个关键影响因素是如何从测序的海量信息中快速确认最有可能引起免疫反应的突变位点，并对肿瘤DNA样本进行准确鉴定和评估。在"An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma"项目中，研究人员利用Biomark HD系统和genotyping实验体系对正常和肿瘤组织中的95个SNP位点进行了多样本多位点的高通量检测分析，为样本的准确性、靶点的挑选和确认提供了进一步的信息。

　　另一个重要因素是对疫苗临床疗效的评估，从而筛选出最有效的疫苗进行接种。在"Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer"文章中，研究人员利用Biomark HD系统和基因表达芯片对接种疫苗前、后，肿瘤样本中的免疫基因表达水平变化进行了细致分析，从细胞因子、信号转导、表型和代谢机理等多角度对疫苗疗效进行综合评估（图3，ref 2）。

图3: Differential gene expression patterns comparing pre -and post-vaccination tumour samples

　　另外，随着研究的进展，患者量的增加和规模化生产，对每一步流程的成本和时间控制也是未来研究中不可忽视的因素。

　　工欲善其事必先利其器

　　来自Parker癌症免疫疗法研究院的研发副总裁Fred Ramsdell博士指出：“这两项研究在本质上最大限度地提高了对仅在单个患者肿瘤细胞上表达的蛋白的反应，这就像你接受了一种针对只会感染你的流感病毒的疫苗。”

　　该研究的前景是非常可观的，而在进一步开发成熟产品并在未来进行规模化生产的过程中，准确、高效、易操作等因素是必不可少的。上述两项研究中，科研人员在研究的不同阶段分别引入了Fluidigm 公司的Biomark HD系统进行基因分型和表达的分析，为产品研发提供了大量的数据基础。

　　该系统作为成熟的高通量基因分析系统，可进行多样本、多参数的基因分析，例如可对多达96个患者样本、每个样本96个位点（96.96）进行同时检测，因此可对肿瘤患者体内的免疫反应进行综合评估，获得全面、细致的表达图谱，从而在快速鉴定个性化突变的基础上找到最为有效的靶点间排列组合。

　　肿瘤疫苗理论上同样适用于其他癌症的治疗，而不同肿瘤类型、不同患者之间基因表达和突变情况广泛存在着差异。利用Biomark HD系统和配套的微流控芯片，可根据实际情况灵活更换或搭配实验体系中的待测位点，减少了对实验设计的限制。

　　目前这两种疫苗都已进入后续研发阶段，两个团队分别成立了公司并正在进行更大规模的I期临床实验。随着规模的扩大和样本量的提高，时间和成本控制也是需要考虑的因素。Biomark HD系统可在4小时内实现近万个数据点的分析，并将每个反应控制在纳升(nl)级体系内，大幅减低了试剂的使用成本。

　　同时，Fluidigm公司开发出了“AdvantaTM Immuno-Oncology Gene Expression Assay”检测试剂盒，涵盖了170个与肿瘤免疫相关的基因。其中包括91个在肿瘤免疫反应中起重要作用的关键基因，这些基因在全球范围内被广泛报道与多种肿瘤的生长和依赖于检测点的治疗反应相关。另外公司通过与世界顶尖实验室和大型制药企业合作，进一步开发了74个肿瘤免疫标记物，帮助用户进行快速全面的指标筛选。除此之外，panel中还包含有housekeeping基因以及开放位点，可以个性化选择、设计实验。

　　我们期待这研究能取得理想成果，早日为患者带来更高效的个体化癌症疫苗！