多重PCR扩增实验

多重PCR（multiplex PCR），其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。

重PCR的特点有：

①高效性

在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。

②系统性

多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检。

③经济简便性

多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息

DNA样本

Taq 聚合酶溶于水的 DNA引物

热循环仪

一、材料

1. 酶和酶缓冲液

Taq 聚合酶
许多 Taq 聚合酶都可以用；作者发现 Roche 公司的 Taq 聚合酶可以满足大多数需要. 如果需要提高PCR 产物的特异性，应该使用热启动聚合酶。使用 Tag 聚合酶本身附带的缓冲液。

2. 核酸和寡核苷酸

（1）溶于水的 DNA

如果 DNA 在 TE 中，应该在 PCR 反应混合物中添加 MgCl₂。如果用从石蜡包埋的组织中纯化的DNA 做模板，选择的 STR 标记的大小应该是 78~250bp, 因为这些 DNA 模板的完整性不定。
参照 DNA 可以从外周血组织或者非恶性组织中纯化获得。对于白血病，則难以获得肿瘤 DNA 的合适的参照 DNA。因此，使用从患病期间和痊愈之后的血液中提取的 DNA 作参照进行分析。
肿瘤 DNA。很难避免非恶性细胞对肿瘤组织的污染。对肿瘤组织进行显微解剖是避免污染的一种途径，但是该过程费时，而且产量低。
为了保证获得 LOH 分析的信患，应该分析大量的样品。因此，纯化过程必须是可靠的，可重复的，保证可以从大量的样品中提取出高质量的 DNA。一种评估肿瘤 DNA 质董的方法就是利用一部分样品，使用 STR 对已经确定的特异类型的肿瘤染色体上的 LOH 进行分析。

（2）引物

重要的一点就是细心地选择荧光基团以确保在所用的电泳仪器上能被检测到。例如，绿色的 TET 就不能在 ABI3100 仪器上使用。
标记的引物储备液可以保存在-20 ℃, 稀释之后的工作液可以在 4℃ 保存。放置黑盒中避光。

3. 专用设备

热循环仪

二、方法

1.在 0.2 ml 的离心管中，加入以下试剂。
 
DNA(溶于水）                              10~20ng

引物（每一种）*                           1pmol/L**

dNTP 溶液                                      250umol/L

Taq 聚合酶缓冲液                           1X

Taq 聚合酶（Roche)                       0.18U

H₂0 加到                                          6ul***

*每一标记组的毎一种引物分别被一种荧光基团标记.

**1.5~2.0pmol 的引物适合于许多反应。

***10ul 的终体积用于带有热盖的 PCR 仪上（样品上层不加矿物油）。


2.使用下面通用的 PCR 扩增程序进行 PCR 操作。

3.在琼脂糖凝胶上分析 3ul 的 PCR 产物。如果使用了新的引物，应用琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。在毛细管电泳之前，从 96 个样品中随机选择几个 PCR 产物进行分析。

4.如果在不同的退火温度下都没有得到 PCR 产物，那么在数据库中査看标记内部的CG 含置和特异的 CpG 岛。大董的 STR，特别是三核苷酸的 STR, 仅由 C 和 G 组成。当PCR 富含 GC 片段时，如第 5 章所述加入甜菜碱和 DMSO。

在多重PCR中，所有引物Ta值应相近。如果两对引物Tq值差异超过±℃10%，会使扩增产物的量明显不同，其中一种扩增产物或目的DNA很难观察到。另外，靶DNA的长度也应相近，差别大时短片的靶DNA会优先扩增，因此，会产生不同产量的扩增产物，为此，须采用DNA摇摆扩增或加入不等量的引物方法进行解决。

多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。

本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。