大肠杆菌基因组基因无痕敲除的优化方法

　　近几十年来， 大肠杆菌是基因工程、 代谢工程和合成生物学等领域的重要工具菌株，是生产重组蛋白、氨基酸、有机酸、能源物质和一些重要化工产品的主力微生物之一。为使大肠杆菌获得新的性状和生产能力， 基因敲除及基因敲入是构建新型大肠杆菌的重要手段。

　　近几十年来， 大肠杆菌是基因工程、 代谢工程和合成生物学等领域的重要工具菌株，是生产重组蛋白、氨基酸、有机酸、能源物质和一些重要化工产品的主力微生物之一。为使大肠杆菌获得新的性状和生产能力， 基因敲除及基因敲入是构建新型大肠杆菌的重要手段。

　　目前，一种基于 λ噬菌体的Red同源重组系统是大肠杆菌等原核生物基因组修饰的主要方法，是遗传育种的有力手段。传统的Red同源重组方法主要是先用两端带同源臂的抗生素基因片段或带有目的基因和抗生素基因片段替换特异的大肠杆菌基因组基因，再把抗生素基因片段通过重组酶（ flippase，FLPｆ） 同源重组去除。但经过这种敲除后的基因组中还残留一个FRT序列的疤痕， 残留的疤痕限制了再次利用该敲除系统进行进一步基因组改造。因此， 一种不留下疤痕的敲除方法已成为近期研究的热点。

　　近期来自大连大学医学院等处的研究人员以无痕敲除大肠杆菌 CLM37基因组nanKETA基因为模型， 通过优化同源双链核苷酸的长度和诱导表达筛选酶的诱导浓度， 建立了快速高效无痕基因敲除体系，为大肠杆菌基因组改造提供了有效方法。这一研究成果公布在《中国生物工程杂志》上。

　　现阶段， 适用于大肠杆菌的无痕敲除方法主要有Red同源重组系统与核酸内切酶I-SceI切割筛选相结合法， 两步Red同源重组系统正负筛选法， Tn5靶向的Cre/loxP切除系统法等。但目前的无痕敲除方法普遍存在如操作步骤较复杂、 周期较长、 重组率较低等不足。最常用的方法是基于Red同源重组系统和核酸内切酶I-SceI的切割筛选作用， 其原理主要通过两步连续的同源重组实现无痕敲除， 即先用带筛选标记的抗性基因和核酸内切酶I-SceI识别序列的片段敲除目的基因片段； 再通过完全与目的基因上下游同源的片段同源重组， 依靠诱导核酸内切酶I-SceI表达， 切割筛选去除未进行重组的菌株， 达到无痕敲除目的。但在第二步同源重组时效率较低， 即无痕化处理效率较

　　低，是该技术的主要瓶颈。

　　在这篇文章中，研究人员以无痕敲除大肠杆菌nanKETA基因簇为模型，利用Red同源重组系统和核酸内切酶I-SceI的筛选作用，通过两步连续同源重组无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因，优化无痕敲除时同源DNA长度与诱导用于筛选阳性克隆I-SceI表达的诱导剂浓度。

　　通过比较敲除nanKETA基因前后菌株的生长曲线，研究大肠杆菌CLM37缺失nanKETA基因后的生长状态。结果研究人员成功无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因，并在无痕化处理时，通过延长与基因组同源DNA的长度，由通常使用的80碱基对延长到684碱基对；并通过提高诱导筛选基因表达的四环素的浓度，由500 μg/ml提高到1000 μg/ml后，使无痕敲除效率高达90%以上。生长曲线研究表明，缺失nanKETA基因后的菌株生长状态与原菌株基本一致。

　　由此研究人员认为通过延长与基因组同源的双链核苷酸的长度和诱导筛选基因表达的四环素的浓度，可显著提高无痕敲除的效率。

　　研究人员指出，通过适当延长无痕化处理时使用的双链核苷酸的长度和提高诱导筛选基因表达的四环素的浓度， 不仅能使得到的重组菌不携带任何抗性筛选标记，达到大肠杆菌染色体基因无痕敲除的目的， 还使无痕化处理效率达到 90 ％以上， 显著提高了无痕敲除的效率， 缩短了实验时间， 为构建特异基因型微生物和微生物代谢途径改造的研究提供了一个非常有效的手段。

　　敲除大肠杆菌中的nanKETA基因， 能提高唾液酸合成效率， 有利于提高唾液酸的产量。唾液酸是一类9碳单糖的衍生物， 在许多生物、 病理和免疫识别过程中发挥着重要的作用， 如细胞粘附、 抗感染、 抗病毒、 肿瘤转移等。这一研究利用 λ噬菌体的Red重组系统， 成功对大肠杆菌CLM37基因组中nanKETA基因进行无痕敲除， 得到nanKETA基因缺失的菌株， 为进一步高效生产唾液酸及唾液酸修饰寡糖的研究奠定了基础。