大肠杆菌感受态细胞制备和转化

实验概要

转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl₂和RbCl法。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。

本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl₂处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp^r）,可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

主要试剂

Ecoli DH5α菌株，pUC18质粒DNA，LB固体和液体培养基，Amp母液，含Amp的LB固体培养基，麦康凯培养基（Maeconley agar），0.05mol/LCaCl₂溶液, 含15%甘油的0.05mol/L CaCl₂

实验步骤

1．受体菌培养

从LB平板上新活化的Ecoli DH5α单菌落,接种于3～5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期.将该菌悬液以1：100～1：50的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2～3小时至OD₆₀₀=0.5左右。

2．感受态细胞制备（CaCl₂法）

（1）       将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下3000 g离心10分钟。

（2）       弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl₂溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15～30分钟后,4℃下3000 g 离心10分钟。

（3）       弃去上清，加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl₂溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。

（4）       感受态细胞分装成200μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。

3．转化

（1）       从冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

（2）       加入pUC18质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟。

（3）       42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3～5分钟。

（4）       向管中加入1ml LB 液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Amp^r）。

（5）       将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24小时。

同时做两个对照：

对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其他操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

（6）计算转化率：统计每个培养皿中的菌落数。

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积

　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)

　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积

　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

注意事项

本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。

1.  细胞生长状态和密度:  不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600  来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107  个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。

　　2.   质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl  的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。

　　3. 试剂的质量： 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。

　　4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌。