大肠杆菌转化实验——高效率电转化法

大肠杆菌

LBSOC

电转化仪离心机分光光度计

1.  接种一个单菌落于5 ml LB培养液，37℃温和振摇培养5 h 或过夜。

2.   将2.5 ml 培养物加人到盛有500 ml LB培养液的2 L 烧瓶中，37℃摇匀振荡培养至OD₆₀₀为0.5~0.6。

3.  细菌在冰水浴冷却10~15 min，然后转移到预冷的1升离心瓶中。于2℃，5 000 g 离心20 min 沉淀用5 ml 预冷的水溶解6。

4.  加入500 ml 冰冷的水，混匀，按步骤3重复离心1次，立即将上清倒掉，用残余的液体重悬细胞。

5.  新鲜制得的细菌

（1）将悬浮液加入到预冷的50 ml 聚丙烯管中，2℃，5 000 g 离心10 min。

（2）估计细胞沉淀的体积，沉淀用等体积的冰冷水重悬。

（3）按50~300 ul 分装于预冷的微量离心管中。

6.  冻存细菌

（1）加入40 ml 冰冷的10%甘油，混合，然后按照步骤5离心。

（2）估计沉淀的体积，然后加入等体积的冰冷的10%甘油，重悬菌体。

（3）按50~300 ul 分装于预冷的微量离心管中。

（4）于干冰上冷冻并贮存于-80℃。

7.  将电转化仪调到2.5 kV、 25 uF ，脉冲控制器调到200~400Ω;。

8.  将1 ul 质粒DNA加入到盛有新鲜制备的细菌或融化的冻存细菌的小管中，混匀。

9.  将转化混合物转移到预冷的电转化池中，吸干池的外表面，然后放入样品槽中。
 

10.  进行脉冲电转化，然后取出电转化池，马上加入1 ml SOC培养液，并且用巴斯德吸管转移到无菌的培养管中。

11.  于37℃，中速振荡培养30~60 min。

12.  分小份涂布于含有抗生素的LB平板上。