大肠杆菌转化实验

质粒DNA 重组DNA

LB培养基 蒸馏水 IPTG X-gal 氨苄青霉素

旋涡混合器 微量移液取样器 移液器吸头 离心管 双面微量离心管架 干式恒温气浴 恒温水浴锅 制冰机 恒温摇床 培养皿 超净工作台 酒精灯 玻璃涂棒 恒温培养箱

一、实验材料准备

1.  器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5 ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。

2.  试剂

培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH₂O，IPTG，X-gal。

3.  材料处理

无菌ddH₂O，1.5 ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。

二、操作步骤

1.  事先将恒温水浴的温度调到42℃。

2.  从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100 ul）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10 min。

3.   加入5 ul 连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100 ng），轻轻震荡后放置冰上20 min。

4.  轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5 min。

5.  在超净工作台中向上述各管中分别加入500 ul LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。

6.  在超净工作台中取上述转化混合液100-300 ul，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

7.  如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40 ul 2% X-gal，8 ul 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
 

8.  在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

9.  在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

10.  观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。

1. 电击之前保持低温状态。

2.电击杯使用完，用针头蒸馏水反复冲洗杯底，再用70%乙醇浸泡，4℃存放，使用前烘干即可，或者烘干后，-20℃冰箱存放。

3.玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂。