大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段实验—随即寡核苷酸引物介导

DNA

TEdNTP

水浴锅

1.  用合适的限制性内切酶消化DNA，DNA片段经电泳纯化或乙醇沉淀，用TE缓冲液重悬。
 

2.  在冰浴中混合下列物质：

（1）2.5 μl 0.5mmol/l  3dNTP混合液

（2）2.5 μl  10×klenow酶缓冲液

（3）5 μl  3000Ci/mmol［α-32P］标记dATP

（4）1 μl  klenow片段

3.  将30~100 ng DNA与随机核苷酸六聚体（1~5 μg）混合至14 μl，煮沸2~3 min，置于冰浴。

4.  加入11 μl 得自步骤2的混合物，立即在室温温育2~4 h。

5.  加入1 μl 0.5mol/l EDTA以终止反应，加入3 μl 10 mg/ml tRNA和100 μl TE 缓冲液。

6.  酚抽提，移上清至一个新离心管中。

7.  用层析法将未掺入的放射性前体dATP从标记DNA中去除。

7.  取出1 μl 小份样品确定³²P的掺入效率。（比活度应为10⁸ cpm/μg）