大肠菌群检测知识及MPN法检测的注意要点

　　一、大肠菌群的定义：

　　1、指一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

　　2、该菌群主要来源于人畜粪便, 作为粪便污染指标评价食品的卫生状况, 推断食品中肠道致病菌污染的可能。

　　3、大肠菌群不是细菌学上分类命名，而是一组与粪便污染有关的细菌。这群细菌包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌。

　　4、生化特征及血清学反应并非完全一致。

　　5、典型大肠杆菌的IMVIC与硫化氢试验结果：++---。

　　二、分布：

　　1、广泛分布于自然环境。

　　2、来源于人和温血动物的粪便。

　　三、卫生学意义：

　　1、大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样品中是否受到粪便的污染。

　　2、大肠菌群计数的高低，直接反映了样品受粪便污染的程度。

　　3、表示对人体健康是否具有潜在的危险性。

　　大肠菌群是理想的粪便污染的指标菌

　　4、是人类和温血动物肠道菌群，在数量上占优势。

　　5、随粪便排出体外后，在外界环境影响下，其存活时间应与肠道致病菌大致相似或稍长。

　　6、检验方法简便，易于检出与计数。

　　7、对消毒剂的抵抗力应不低于肠道致病菌。

　　四、大肠菌群检验MPN法接种量剖析：

　　接种量问题，GB 4789.3 -2016中 7.2 初发酵试验规定“选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管LST肉汤，每管接种1mL（如超过1mL，则用双料LST）”。这里所说的接种量1mL并非1mL样品接种量（即MPN检索表中的1mL样品接种量），而是接种的稀释液的体积V=1mL（为了区分，本文中用V表示），那么实际的接种量m（为了区分，本文中用m来表示）为m×p（p为稀释液浓度）。那么括号中的接种量超过1mL就是要V＞1mL，而MPN检索表中的实际接种量都为10-n系列数，所以V也只可能是10mL（100mL在实际中不可能），也就是说接种体积V=1mL，用单料，V=10mL用双料。

　　例如：25g样品＋225mL缓冲液—1：10稀释液

　　 1：10稀释液+9mL缓冲液—1：100稀释液

　　若：1：10稀释液接种10mL至双料LST，接种量为：10mL×0.1g/mL=1g

　　1：10稀释液接种1 mL至单料LST，接种量为：1mL×0.1g/mL=0.1g

　　1：100稀释液接种1 mL至单料LST，接种量为：1mL×0.1g/mL=0.01g

　　培养基装量在GB 4789.3-2016中没有作任何说明，所以各人的理解更是不一，可能有的人单双料都用10mL，有的人用9mL，有的更多或更少。那么到底培养基装量有没有什么规则，是不是怎样都行？

　　其实不是，GB/T 5750.12—2006中总大肠菌群检测方法中2.1.5.1.1中使用的是单料双料都是10mL，这实际上是为了使得接种稀释液后所有的发酵管培养基浓度达到培养基本身的使用浓度。双料10mL，再接种10mL稀释液后浓度降低一倍就还原了培养基本身的使用浓度，而单料它本身就是培养基的使用浓度，那么接种1mL稀释液后为了使培养基的浓度不至降低太多，就要让培养基装量尽可能的多，但是试管的装量也是有限度的，所以选择装量在10mL左右比较合适。

　　五、大肠菌群检验MPN法注意事项及要点：

　　1、MPN法注意事项：

　　•全过程不得超过15min。

　　•样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，

　　•（如接种量需要超过1mL，则用双料LST肉汤）

　　•以48h±2h为最终观察结果时限。结果也以此时为最终结果。

　　2、MPN法培养基：LST、BGLB：

　　（1）月桂基磺酸盐胰蛋白胨（LST）

　　月桂基磺酸钠能抑制革兰氏阳性菌的生长，同时比胆盐的选择性和稳定性好。由于胆盐与酸产生沉淀，沉淀有时候会使对产气情况的观察变得有些困难；

　　•乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠道致病菌；

　　•胰蛋白胨提供基本的营养成分；

　　•LST肉汤是国际上通用的培养基，与乳糖胆盐肉汤的作用和意义相同，但具有更多的优越性。

　　•发酵试验判定原则：产气为阳性。

　　•检测步骤减少（不必分离培养），检测时间缩短24h。

　　•注：如接种量超过1mL，则应用双料LST肉汤

　　（2）煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）

　　胆盐可抑制革兰氏阳性菌。

　　•煌绿是抑菌抗腐剂，可增强对革兰氏阳性菌的抑制作用。

　　•乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠道致病菌。

　　•发酵试验判定原则：产气为阳性。由于配方里有胆盐，胆盐遇到大肠菌群分解。

　　•乳糖所产生的酸形成胆酸沉淀，培养基可由原来的绿色变为黄色，同时可看到管底通常有沉淀。

　　3、MPN检索表的应用：

　　MPN（最可能数most probable number）是表示样品中活菌密度的估测。因此MPN值只是活菌密度的估算值，并不是样品中活菌数的真值。

　　4、使用MPN检索表的注意点：

　　•这个MPN检索表是ISO、FDA、AOAC、USDA/FSIS、北欧等标准通用的。

　　•表里的数字是有小数点的。

　　•报告单位不同。现报告单位为g/ml，而原报告单位是100g/ml。

　　•原标准MPN表有64个组合，而现标准MPN表只有40个组合。

　　当实验结果在MPN表中无法查找到MPN值时，如：阳性管数为122，123，232，233等时，建议增加稀释度(可做4~5个稀释度)，使样品的最高稀释度能达到获得阴性终点(如果污染程度不能判定，则多加一稀释度)，然后再遵循相关的规则进行查找，最终确定MPN值。