大量细菌克隆的杂交方法筛选实验

重组质粒转化的 E.coli

LB 或 SOB 琼脂板 平头镊子 18 号针头 硝酸纤维素膜 注射器 Whatman 3 MM 圆形滤纸

一、材料

1. 培养基

(1) 含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板。

本方案中使用 2~3 天旧板效果最好，因为旧板更容易吸收接种物中的水分。

(2) 含有适当抗菌素和 25% (V/V) 甘油的 LB 或 SOB 琼脂板。

(3) 含有氯霉素的 LB 或 SOB 琼脂板。

氯霉素贮存液浓度应为 170~200 μg/ml。

2. 专用设备

平头镊子（如 Millipore 镊子）

18 号针头

硝酸纤维素膜（Millipore HATF，或相当产品）或尼龙膜，无菌无去污剂污染

注射器（3 cc）

Whatman 3 MM 圆形滤纸。（提前准备一叠 Whatman 3 MM 滤纸（毎一硝酸纤维素或尼龙膜各准备一叠，还要加一些备用品），并裁减成比滤膜稍大一点。一些厂家已有预制好的圆形滤纸出售。用铅箔包好滤纸，高温高压消毒 [ 15 psi ( 1.05 kg/cm²) 10 min ]。

3. 载体和菌种

重组质粒转化的 E.coli，用作培养物。

或

扩增的 cDNA 文库，生长为培养物。

二、方法

1. 用软铅铅笔或圆珠笔在干滤膜上作好标记，用水浸湿后将湿滤膜夹在干的 3 MM 滤纸之间，用铝箔松散地包好，液相循环高温高压消毒 [ 15 psi (1.05 kg/cm²) 10 min]。

准备足够的滤膜用来从起始板制备 1 或 2 张备份。备份最好用消毒的无菌滤膜，但如果不再从主板制备备份，未消毒的滤膜也可以用。

2. 用平头镊子将一张消过毒的滤膜，标记面向下，置于含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板已制备 2~3 天，滤膜完全浸湿后，将其从板上揭下，翻过来标记面向上，再置于琼脂板表面。

3. 将小体积的菌液置于琼脂板表面的滤膜中心，用一个无菌玻璃棒使菌液分散，在滤膜四周留出 2~3 mm 宽的无菌区。

大滤膜（直径 137 mm）可提供 0.5 ml 细菌悬液，含 2X10⁴ 个活菌；小滤膜（直径 82 mm) 提供 0.2 ml 细菌悬液，含 ~10⁴ 个活菌。

4. 将琼脂板的盖半开（不要倒置）置于通风橱内数分钟使接种物中的水分蒸发，盖上盖子，颠倒琼脂板于 37℃ 培养直至出现直径 0.1~0.2 mm 的小菌落（约 8~10 h)。

5. 如需要，可在此时按步骤 6 制备备份滤膜，否则按以下步骤使菌落可冻存于 -20℃：

(1) 将滤膜菌落面向上转移至含有适当抗菌素和 25% 甘油的 LB 或 SOB 琼脂板表面。

(2) 于 37℃ 培养 2 h。

如进行 cDNA 文库筛选，最好将主板冰冻。冰冻可减少真菌污染使主板保存数月。含有抗菌素但不含甘油的 LB 或 SOB 板上的主滤膜可在 4℃ 保存 2 周。

(3) 用 Parafilm 膜封好琼脂板，颠倒置于封闭的塑料袋的于 -20℃ 保存。

于室温使主板（仍以颠倒位置 ) 解冻后即可制作备份。

6. 将主膜（硝酸纤维膜或尼龙膜）菌落面上置于无菌的 Whatman 3 MM 滤纸上。

7. 标记一张湿的硝酸纤维膜或尼龙膜，置于主膜上，防治在两膜之间形成气泡。

最好将第二张滤膜稍微卷曲，以使两张滤膜首先在中部接触。两膜一旦接触，就不要相互移动。尽量使两张滤膜不要完全重叠，以便于以后使两者分离。

8. 在滤膜上再盖一张圆形 3 MM 滤纸，并在滤纸上放一个培养皿，用手掌向下紧压培养皿以使细菌从主膜转到滤膜上。

9. 拿掉培养皿和顶层 3 MM 滤纸，用连接注射器的 18 号针头在双层滤膜作一些空，以作标记方位。

确保针头剌穿两层滤膜。

10. 使两膜分开，将备份膜置于新鲜的含有适当抗菌素的 LB ( 或 SOB ) 琼脂板。

此时，可按步制备第二张备份，用主膜上已有的孔标记第二张备份膜。

11. 将另一张备份膜和主膜置于新鲜的含有适当抗菌素的 LB ( 或 SOB) 琼脂板，于 37℃ 培养，直到长出菌落（4~6 h)。

12. 这一阶段，当细菌生长依然很快，滤膜可以转到含有氯霉素的（170~200 μg/ml) 的（或 SOB ) 琼脂板，于 37℃ 培养 12 h。

13. 将主膜转到新鮮的含有适当抗菌素和 25% 甘油的 LB ( 或SOB ) 琼脂板，而后按步骤 5 冻存。

14. 裂解附着于备份膜上菌落，将释放出的 DNA 固定于硝酸纤维膜或尼龙膜。进行杂交。