大鼠血清、血浆及相关样本视黄醇结合蛋白4(RBP4)含量检测

实验概要

本实验采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。将标准品、待测样本加入到预先包被大鼠视黄醇结合蛋白4(RBP-4)单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中大鼠视黄醇结合蛋白4(RBP-4)浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中大鼠视黄醇结合蛋白4(RBP-4)含量。

主要试剂

1. 大鼠视黄醇结合蛋白4(RBP-4)定量检测试剂盒(ELISA)

2. 蒸馏水

主要设备

1. 37℃恒温箱

2. 标准规格酶标仪

3. 精密移液器及一次性吸头

4. 一次性试管

5. 吸水纸

实验步骤

1. 准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。

2. 配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。

3. 加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍)；空白对照孔不加。

4. 温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。

5. 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。

6. 加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。

7. 温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。

8. 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。

9. 显色：每孔先加入显色剂A 液50μL，再加入显色剂B液 50μL，平板混匀器混匀30s(或用手轻轻震荡混匀30s)，37℃避光显色15min。

10. 终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。

11. 测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。

12. 计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。

注意事项

1. 样本不能含叠氮钠(NaN3)，因为叠氮钠(NaN3)是辣根过氧化物酶(HRP)的抑制剂。

2. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能立即试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

3. 样本应充分离心，不得有溶血及颗粒。

4. 实验严格按照说明书的操作进行，实验结果判定必须以酶标仪读数为准。

5. 酶标包被板开封后如未用完，应立即装入密封袋中加干燥剂保存。

6. 建议所有的标准品、样本和空白对照都做双份检测，取平均值，以减小实验误差。

7. 牢记样本已经稀释5倍，计算结果乘以5才是样本实际浓度。

8. 本试剂盒定量范围为0.5-16μg/L，超过此范围，为标准曲线延伸计算所得，不做为准确定量结果，请用特殊稀释液稀释后测定准确结果(0.5-16μg/L范围内)，乘以总稀释倍数即为样本最终浓度。

9. 若显色过浅，可适当延长底物温育时间。

10. 为避免交叉污染，标准品、样本和空白对照每加一个就要更换一次吸头；酶标工作液、样本稀释液和底物等公共组分，要悬臂加样，不得碰到微孔；不得重复使用封板膜。

11. 试剂盒保质期内使用，不同批号的试剂不得混用。

12. 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。