如何利用LAMP引物设计平台设计IMSA引物？1

IMSA，全称为isothermal multiple-self-matching-initiated amplification，中文名为等温多自配引发扩增。该技术的详细介绍可见本公众号历史文章：“分子诊断万花筒” 开篇——等温多自配引发扩增技术简介。在这里隆地熊为大家介绍一种如何利用LAMP引物设计平台去设计IMSA引物的方法。

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在进行引物设计前，通过比对软件获得所测基因的保守序列是必不可少的前提。这样做的目的是排除物种特异性，防止交叉反应。如何获得基因的保守序列，具体操作可见“分子诊断万花筒”小白篇——如何设计PCR引物（一）。

     当获得保守序列后，可以利用LAMP引物设计平台进行IMSA引物设计。当然，也可以根据IMSA引物设计的原理，利用PCR引物设计软件进行设计。但个人建议选择前者。为了方便阐述，本文以设计针对EV71VP1基因检测的引物作为例子。

1. 建立EV71VP1 gene.txt文件，将所获得的保守序列复制粘贴到其中。

2. 打开LAMP引物设计平台（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）并上传导入EV71 VP1 gene.txt文件。

3. 无需做ParameterSet，直接点击Primer Design并进入引物设计界面。

4. 当直接点击Generate时，平台只提供了一套系统默认的LAMP引物。数量过少显然满足不了IMSA引物设计。此时，需要点击DetailSetting以获得更多套LAMP引物。

5. 点击DetailSetting后，再点击Generate，平台可提供的LAMP引物增加到25套。然而，当点击Display时，所呈现的引物实际上是同一类引物，因为F1c和B1c的位点几乎一致。

Tip 1: 利用LAMP引物平台来设计IMSA引物的重中之重就是寻找F1c和B1c位点可高度重叠（即完全互补）的不同引物组合，还要兼顾每套引物能不能设计出所需的环引物来。