如何提高PCR特异性

一天P几百管的人可能不用担心条带有没有，而对于刚入门分子生物学的人来说，PCR能看到条带，能看到特异性好的一条明亮的带就是入门zui大的欣慰。师姐会告诉你，引物设计很重要，不能有二聚体和发夹结构；师兄也会和你说退火温度很重要。提高PCR特异性可谓是仁者见仁，智者见智。以下搜集了网友们的讨论，精华汇总如下：

提高PCR特异性的策略

1. 巢式PCR（Nest-PCR）：增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，降低了扩增多个靶位点的可能性，提高困难PCR（如5‘ RACE）特异性 。

2.递减PCR（TouchDown PCR）：前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性，循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃，特异性zui高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势，递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等 。

3.热启动PCR（HotStart PCR）： 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度，通常选择热启动Taq酶，热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性zui重要的方法之一 。

4.使用PCR增强剂：甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等，可能的机理：降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过，二级结构区，增强剂浓度要适当。

freecell

1, 降低模板浓度

2、热启动PCR

3、touchdown PCR

4、设计Tm值超过72C的引物

强烈建议第3种

如果模板是cDNA或基因组之类的建议预变性时间长点，可以用95℃10min。另外，Tm不能太低。一般变性温度95℃相比较94℃而言利大于弊，退火时间太长会导致非特异扩增。合成速度1Kb/s，所以40S足够了，延伸时间过长也会容易导致非特异性。另外不知道你是只为了扩出目标条带还是打算要做定量PCR？前者的话将产物割胶后做巢式PCR一定可以解决。如果定量的话建议重新设计引物，因为按我的经验，即使你按照我上面的程序优化，虽然可能会有改善，但实质性改善的可能性不大。另外，一般cycle数不要超过35，因为如果此时还扩不出产物，引物二聚体一般都出现，再扩下去也只是主要扩增引物二聚体。