如何研究lncRNA？三位科学家现身说法

　　人生如戏，相信长链非编码RNA（lncRNA）也体会到了。之前一直遭冷遇，如今却是万人迷。其实，人类及其他哺乳动物的基因组转录了数万条lncRNA。根据GenCode数据库中最新版本的数据，人类基因组中包含16,000条lncRNA，产生了近28,000条转录本。再加上其他数据库的数据，目前已知的lncRNA超过40,000条。

　　这些类似mRNA的转录本在各种基因调控水平和胚胎发育等生物学过程中发挥作用。越来越多的证据也表明，异常表达的lncRNA在多种疾病状态中发挥重要作用，如癌症。这些RNA尽管在十几年前就已经发现，但只有少数分子的功能得到鉴定。

　　德克萨斯大学西南医学中心的药理学教授David Corey表示：“你必须从检测非编码转录本开始。”他的研究方向是将lncRNA作为药物靶点。“我对这些数据库不感冒，因为可能存在错误。他们可能检测到你的细胞系中不存在的RNA或很少量的RNA。”

　　若并非全基因组范围内的检测，Corey博士通常利用定量PCR来检测非编码转录本。“如果我们认为那儿有一条非编码转录本，我们就用5’和3’ RACE来扩增和检测这些区域，”他说。“了解它的起始位点和终止位点是件好事，但不一定是必需的。如果你主要对功能感兴趣，那么就不用了解全部情况，若存在重叠的转录本，检测起来也比较困难。”

　　如果转录本的确存在，下一步则是利用逆转录来生成RNA，“或者购买一条适当长度的RNA，但是序列必须相同，”Corey博士说。“你必须使用完全相同的qPCR引物，否则失之毫厘，谬以千里。”

　　当然，与mRNA相比，分析这些lncRNA面临独特的挑战。据ArrayStar的资深科学家Yanggu Shi介绍，lncRNA的丰度水平通常比mRNA低十倍，而且组织特异性高，近80%的lncRNA是组织特异的，但mRNA不到20%。lncRNA的注释比较少，因为它们不编码蛋白质。此外，一些lncRNA没有poly(A)尾。它们大多位于细胞核中。“基于这些原因，我们需要一些特殊方法来分析和注释，”Shi博士说。ArrayStar专门开发分析RNA表达和调控的工具，特别是调控性的非编码RNA。

　　举个例子，RNA测序通常产生4000万条序列，但lncRNA的测序覆盖度太低，不足以进行可靠定量。“利用这种方法，lncRNA测序至少需要1亿条序列，比常规的mRNA测序要多得多，”Shi博士解释道。“相比之下，芯片受低丰度转录本的影响没那么大，且错误定量的几率较低。”

　　据Shi博士介绍，ArrayStar的lncRNA芯片带有许多注释，得到实验支持，并被许多文献引用。比如，ArrayStar芯片曾出现在《Nature Cell Biology》的一篇论文中，说明三阴乳腺癌中的细胞质LINK-A lncRNA激活了常氧下的HIF1α信号通路1。

　　最近，lncRNA序列的系统分析也取得了很大进展。Broad研究院（现科罗拉多大学）的John Rinn博士系统分析了影响核定位的lncRNA序列。他们开发出一种大规模并行报告检测（MPRA），可鉴定出38种人类lncRNA中与核富集相关的序列。这项成果于2017年9月发表在预印本网站bioRxiv上2。

　　“大规模并行报告检测对DNA很有用，”Rinn博士说。“它们挖掘出一切看似活跃的东西，并确定哪些是真正活跃的。我们也需要类似的技术来研究RNA的核富集。因此，我们将100,000条寡核苷酸混合在一起，看看哪些能将细胞质的报告基团带回细胞核。只要你选择活跃或非活跃，我们就能将它们分开。”

　　利用这种方法，Rinn博士及其团队鉴定出109个独特且保守的核富集区，它们来自29个不同的lncRNA。他们还在核富集区中发现了两个较短的motif，并利用单分子RNA荧光原位杂交（smRNA-FISH）进一步验证了几个区域是否足以影响核定位。

　　“对于RNA而言，这一切都归结为结构，”Rinn博士说。“以研究最为透彻的RNA为例，端粒酶RNA（TERC）。它是生存所必需的。酵母和人类的端粒酶的大小和序列不同，但它们可以交换，仍然起作用。进化并没有保留这个基因的序列，但保留了它的结构和结合伴侣。通过这种分析，我们可以改变序列，但保留结构，看看它们是否仍然能结合。”

　　Corey博士则在继续寻找可能成为治疗靶点的lncRNA。“目前，我们特别感兴趣的是一个内含子中的重复扩增，它与Friedrich共济失调相关联，”他说。“如果我们能够上调这个靶点，则有望治疗这种疾病。”