如何设计嵌套PCR引物以及注意事项

嵌套 PCR 又称巢式 PCR（nested PCR,nPCR）,是指以第一次 PCR 产物为模板直接进行第二次 PCR 扩增，以增加 PCR 的灵敏度，第二次 PCR 设计的引物在第一次所用引物对的内部，这种引物被称为「内部」或 「嵌套」引物。

以第一次 PCR 产物为模板进行第二次 PCR 扩增，可明显提高敏感度而对特异性无损（Albert and Fenyo 1990)。

由于嵌套 PCR 使用两套引物对，在补充反应组分如 Tag DNA 聚合酶后就可能提髙总循环数。如果不能进行完整的嵌套 PCR (使用两个内部引物），为提髙灵敏度和特异性，可设计半嵌套 PCR，即只用一个内部引物，与来自第一次反应的外部引物结合使用。

嵌套 PCR 的最大问题是它易受污染。必须将第一次 PCR 的反应管打开，将初级产物转移 到新管，以进行第二次反应。其缺点也包括进行两轮 PCR 需要额外成本和额外进行引物合成。

为了降低污染风险，可使用一种被称为 drop in/drop out 嵌套 PCR 的单管 PCR 方法。 在该方案中，设计的内部引物的解链温度显著低于外部引物对。两对引物都被加于第一次反 应中。在首轮 PCR 过程中，选择只能使外部引物对退火和延伸的退火温度。在第二轮扩增 过程中，降低退火温度，使内部引物对能发挥功能。虽然从污染控制的观点考虑该法具有吸 引力，但其不能提供最初的嵌套 PCR 方案的所有优势。

设计策略

PCR 引物设计的一般规律对嵌套 PCR 的引物设计也同样适用。由于使用多对引物，应考虑到引物之间相互作用的可能性明显增大。当设计引物用于单管嵌套 PCR 时，比较重要 的一点是内部（被嵌套）引物的解链温度应显著低于外部（首轮）引物，最简单的办法是缩短被嵌套引物的长度（如 18~20 个碱基相对于 25~28 个碱基）。

外部引物对的 Tm 值应足够髙，以防止内部引物退火，确保在首轮 PCR 中只产生较长的产物。相对于外部引物，应 额外多用内部引物（一般多于 40 倍）。在进行第二轮 PCR 时，选择较短的退火和延伸时间， 以促进较短的引物退火，提髙较小复制子的产量。