如何选择层析方法

当目标蛋白的物理特性如分子量、等电点等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同pH缓冲液的试管中，可简单地测出pI， 并确定纯化用缓冲液的最佳pH。

选择层析方法

在对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：

　　一、使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广泛的介质如Superose、Sephacryl HR根据分子量将样品分成不同组份。

　　二、用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。也可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一部即可得到高纯度样品。

　　三、大体积的样品、常使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。

纯化大量粗品

处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用Sepharose Big Beads、SepharoseXL、Sepharose Fast Flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE截止，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一，提高回收率，缩短纯化周期。

纯化硫酸氨样品

硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，先用HiTrap HIC Test  Kit和RESOURCE HIC Test KIT可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其他吸附性层析。

纯化糖类分子

固化外源凝集素如刀豆球蛋白、花生、大麦等的凝集素，结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组分、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，可俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。

纯化膜蛋白

膜蛋白分离长使用去污剂使其保持活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白电荷相反者，以避免在作离子交换时蛋白竞争交换介质，藉此除去去污剂。非离子性去污剂可用疏水层析法除去。

纯化单抗、抗原

单抗多为IgG，来源主要是腹水和混合瘤培养上清夜。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Protein G和ProteinA对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步醇化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG。

重组蛋白A介质rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的栽量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose   Hp或凝胶过滤Superdex 200，很容易去除。   疏水层析pheny1 Sepharose HP也很适合纯化IgG。

宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。 HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mg IgM。HiTrap IgY是专门用来从蛋清里纯化IgY，结合量达100  mg纯IgY。

纯化重组蛋白

重组蛋白在设计、构建时应已融化入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合作粗分离。