宏基因组测序技术助力腹泻暴发调查中病原体识别

　　腹泻病一直是世界范围内主要流行和重要的致死性疾病之一，同时也是导致5岁以下儿童死亡和营养不良的第二大原因。不论在发达国家还是发展中国家，病原体导致的腹泻是食品安全最主要的问题、以及人群健康的重要威胁。另外，虽然人类医学条件得到了极大的提升，但因为腹泻发病率高、病原体耐药率高，使腹泻病的治疗和防控变得愈发具有挑战性。

　　及时有效地鉴别病原体对腹泻的治疗和预后意义重大。传统的微生物检测方法，例如病原确认的生化反应、显微观察和染色、质谱鉴定等，均需要对样本进行培养，从样本中得到单菌落后才可以进行鉴定。该类方法缺乏时效性，主要针对已知少数病原体开展培养，且不能针对非可培养的微生物种属。对样本进行病原特异基因扩增检测，还受到样本背景杂质干扰扩增反应而影响灵敏度、只能检测已知病原等的限制。因为腹泻病原体种类多，尤其在临床检验室，还大大受限于操作复杂和费时费力、方法选择和操作主观性强等因素的影响，例如对腹泻病例进行增菌培养分离的方法选择、菌落挑选等，均造成病原判断的困难。近年来，也发展了16S rRNA基因测序鉴定微生物种类，但该测序方法只能得到样本中细菌的构成情况，无法满足疾病的诊断和后续指导治疗需求。

　　宏基因组测序技术不依赖于样品培养，可以一次性获得样本中微生物，对病原学诊断具有全覆盖、高效率等优势，已广泛应用于临床病原学诊断中，例如在脑脊液和血流感染中的应用，但在腹泻病原体鉴定中的应用研究还相对较少。

　　对于多数腹泻感染个案，虽在目前阶段也需要考虑宏基因组测序诊断技术的成本-效益问题，但在腹泻暴发事件的病原确认和防控中，因为暴发事件社会影响大，病原导致疾病以及传播威胁严重，是腹泻防控、食品安全管理和人群健康保障的重要关注点，需要发展更准确的、非主观选择技术方法准确鉴定病原，实施精准防控。

　　近日，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、传染病预防控制国家重点实验室研究团队联合黑龙江省疾病预防控制中心、河南省疾病预防控制中心的研究人员，通过对两起聚集性腹泻暴发事件样本进行宏基因组测序寻找共同病原体序列，并与传统使用的病原分离鉴定、病原菌基因扩增检测方法进行比较，系统探索评估了宏基因组测序技术在腹泻暴发中的潜在应用价值。结果显示，宏基因组测序在探索腹泻样本中的病原体时，是一种全面系统、无偏、更灵敏的方法，可为未来快速诊断腹泻暴发中的病原体、乃至进一步精准防控提供技术基础和依据。

　　文章发表在《疾病监测》

　　主要内容

　　腹泻暴发样品宏基因组测序及分析

　　研究收集了2017年地方报告的两起聚集性腹泻暴发事件样本，对每起暴发案例中的数份样本进行了宏基因组测序。在文库构建及测序环节中，研究人员使用华大智造MGIEasy酶切DNA文库制备试剂盒进行DNA文库构建，以及华大智造基因测序仪MGISEQ-200RS进行PE100测序。获得测序数据后进行后续的生物信息学分析，如图1所示。研究中同时与暴发处置时应用的荧光PCR检测致病菌、细菌分离培养等常规方法进行了比较。

　　图 1. 腹泻暴发样品宏基因组测序及分析判断流程。

　　案例1样本分析

　　应用常规的多重荧光PCR检测显示5份腹泻便样本中均检出副溶血性弧菌，诺如病毒及致泻性大肠埃希菌检测均为阴性。宏基因组测序结果显示，5份腹泻样品标本均检测到了一定丰度的副溶血弧菌核酸序列数，为291～799，相对丰度为0.005%～0.012%。但同时5份样本均检测到了更高丰度的沙门菌核酸序列数，为5486～31874，相对丰度为0.084%～0.797%。粪便样品中还存在一些常见菌，但无明确已认知的其他致病菌。

　　根据此案例分析可发现，因为现场处置时根据可疑暴露食品和经验判断，采用多重荧光PCR检测时没有选取针对广泛病原体包括沙门菌的检测试剂，导致没有发现沙门菌，出现漏诊；暴发中多个样本的宏基因组测序鉴定到所有样本均含有沙门菌和副溶血弧菌基因组序列，判断该腹泻暴发事件是由沙门菌和副溶血弧菌的混合感染所致，这也提示此次疫情食品感染来源的复杂性。在鉴定腹泻暴发样本中的病原体时，宏基因组测序不需先验知识进行预判，可以避免引入主观误判造成的偏差，并有利于发现混合感染、变异病原甚至新病原。

　　图2. 案例1中5份样品相对丰度较高的共有种属。

　　案例2样本分析

　　疫情处置时，对13例病例粪便样本进行了多重荧光PCR检测病原基因，发现有3例为志贺菌/侵袭性大肠杆菌（EIEC）基因阳性。在宏基因组测序研究中，选择了3份粪便样本（包括1份多重荧光PCR法结果为志贺菌/侵袭性大肠埃希菌阳性、2份多重荧光PCR法结果为阴性）进行测序，结果显示3份样本中均检测到一定丰度的志贺-埃希群的核酸序列数，为2993～153762条，相对丰度为0.014%～0.649%。未发现其他致病菌特征序列。由此案例结果可以发现，在鉴定腹泻混合感染病原体时，当测序深度满足时，宏基因组方法比传统方法更灵敏，可检测到更多的病原体，更加有效。

　　图3. 案例2中3份样品相对丰度较高的共有种属。

　　结 语

　　当前腹泻暴发中病原体的确认主要依赖于常规的分离培养、菌落挑选、生化与血清鉴定、多种病原体的特征基因扩增检测等，时间长、灵敏度低、只能针对已知常见病原，并且方法选择和判断主观性强。宏基因组测序为鉴定腹泻暴发样本中的病原体提供了有力手段，不需主观选择，灵敏度高，判断证据充分得多，虽然因肠道菌群复杂、对于腹泻病例个案的感染病因病原判断有一定限制，但在腹泻暴发中，由于具有多个病例样本间序列数据分析的相互验证，因此，为明确病原菌的感染提供了更强的技术保障。由于具有快速检测样本中整体微生物群落结构的潜力，宏基因组测序已然成为临床样本病原体鉴定和耐药/毒力基因检测的一个有力工具。尤其在没有先验知识的情况下，宏基因测序在检测病原体上更具显著的优势，并在新发病原体鉴定中发挥着不可替代的作用。

　　参考资料：

　　崔志刚, 遇晓杰, 赵嘉咏, 张剑峰, 周海健, 李臻鹏, 阚飙, 卢昕. 宏基因组测序在腹泻暴发调查中的应用[J]. 疾病监测, 2021, 36(6): 616-621.