定量PCR实验技术分享

1.  如果扩增曲线ct值比较靠后的话，32左右，一般有什么方法解决？

ct值比较靠后，对实验有一定的影响，因为经过那么多次的循环，酶的活性有可能有所下降，这时候扩增效率会有所改变（而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值）。因此最好能够把ct值往前移。

解决办法可以将模板加以浓缩或者抽干之后用少量水去溶解。

2. 为什么合成的引物做不加摸板的对照也能扩增出目的条带，而内参用同样体系就没有呢?

引物被污染。

3. 实时定量PCR，荧光定量PCR，实时荧光定量PCR，real－time PCR，这些是不是同一个概念

是一个概念。

4. 我的标准曲线的slope总是大于４，而且每个梯度的平行ct值差别比较大，原因？

这个斜率是＝1/LOG 10(扩增效率)，理论上扩增效率＝2，斜率是3.322。如果斜率大于4，说明扩增效率比较小。可以考查一下反应体系是否合理？酶活是否正常？

平行管的CT值差别大可以考查一下自己实验操作是否规范，另外一种原因就是仪器本身的误差也可能会导致CT值差别比较大。

当斜率为4的时候，扩增效率是77.8%，斜率大于4的话，效率继续下降。

扩增效率的问题实际就是引物的扩增效率，可能酶活的关系没有那么重要，前提是试剂盒的质量有保证。回到扩增效率，只有在引物和模板处于最适比例时才能得到比较满意的扩增效率，因此通过调节PCR反应体系中的引物终浓度来解决，可以做一些引物梯度来比较。

5. ROX染料是什么作用？

ROX的作用ABI宣称是用来校准加样误差的。

但是据说ROX的作用实际上是用来校准光程差的。即每个孔的荧光信号经过滤光片在经过聚焦到CCD的时候，走过的光程是不一样的，这样在CCD上成像的亮度就不一样了。所以需要把这个差异用ROX来计算孔间差异有多大，然后差异系数去处理，实际的荧光信号。具体过程我不是非常清楚，请高手指正。

6. 荧光定量PCR的基线，是怎么确定的呢？

基线就是背景值，因此就是曲线在没有“起跳”之前的一段。在软件上有一个地方可以输入baseline从第几到第几cycle作为基线。设置原则是使没有起跳之前最多的cycle的信号接近0。