定量PCR常见问题及对策

Q1．无CT值（信号）出现
A1．1.反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2.检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3.引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。
4.引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5.模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6.模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

Q2．CT值出现过晚
A2.1.扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3.PCR产物太长。一般采用80-150bp的产物长度。

Q3．标准曲线的线性关系不佳
A3.1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2.标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3.引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针
4．模板中存在抑制物，或模板浓度过高

Q4．阴性对照也出现明显的起飞
A4．1.应mix或水被污染。
2.引物二聚体的出现。用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
3.反应过程中探针的降解。用PAGE电泳对探针进行检测。
4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。

Q5．在溶解曲线前是否插入一个同溶解程序初始温度相同的一个保温过程
A5．如果在熔解曲线前没有一个保温过程，则曲线会在前几个循环非常陡峭，使真正的熔解峰型几乎看不到。

Q6．熔解曲线不止一个主峰
A6．1．引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2.引物浓度不佳。适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3.镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
4.模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

Q7．扩增效率低
A7．1.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
2.反应条件不够优化，可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
3.反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

Q8．实验重复性不好
A8．1.加样不准确。
2.仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。
3.模板浓度低。样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。

Q9．变性温度是否合适
A9．大部分的双链DNA在95°C就开始解链了，在有些情况下在90至94°C都不能很好地变性DNA。由于部分变性，参加反应的探针和引物相应的减少了，因此反应效率会下降。

Q10．变性时间是否合适
A10．15到20秒对于变性扩增子是足够了，然而，长一点的产物，可能会需要30秒，60秒的变性时间通常是不需要的。

Q11．退火温度和时间是否合适
A11．检查引物和探针的Tm值，SYBRGreenI的退火时间大约20到35秒，双标记探针通常是两步法，退火和延伸合并为一步，时间大约是45到60秒，温度通常在60°C，对于FRET探针退火步骤大约20到30秒。

Q12．在哪一步骤采集信号
A12．SYBRGreenI应当在72°C，此时绝大部分的DNA是双链状态，如上所述，双标记探针通常是两步检测，因此信号采集应该在退火延伸的整合步骤。对于FRET检测，数据应该在退火步骤检测。如果对于信号采集点不确定，可以多点采集作对比。如果监控屏幕检测不到信号，检查程序设定是否存在至少一个的信号采集点。

Q13．是否选定了合适的增益值
A13．一些情况下会看到曲线超过了窗口范围，在荧光强度100的地方成一直线。尽管大部分的数据可以用，但是减少增益，一些原始数据就不会超出范围。有时，在第一个循环信号就跳出了窗口范围，这是由于增益选得太高，看起来像没有检测到数据。如果熔解曲线分析时，开始荧光就达到了100，则应当用低的增益重新运行，而不需要重新运行扩增反应，SYBRGreenI和FRET的样品可以在一定程度上反复使用